全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (10): 1053~1056 1053
收稿 2013-06-21　　修定 2013-07-15
资助 国家自然科学基金(31171923)、国家转基因生物新品种培
育重大专项(2014ZX08009-3)和高校博士学科点专项科研
基金(20103702110003)。
* 通讯作者(E-mail: hqyang@sdau.edu.cn, labft@sdau.edu.cn;
Tel: 0538-8249304)。
苹果砧木‘青砧一号’离体高效再生体系的建立
吴瑞刚1,2, 杨洪强1,2,*, 沙广利3, 杨萍萍1,2, 毕润霞1,2
1山东农业大学园艺科学与工程学院, 山东泰安271018; 2作物生物学国家重点实验室, 山东泰安271018; 3青岛市农业科学研
究院果茶研究所, 山东青岛266100
摘要: ‘青砧一号’是杂交育成的苹果矮化砧木新品系。本文探讨了影响‘青砧一号’离体再生的条件, 建立了高效离体再生
体系。结果表明, 以叶片为外植体, 远轴面接触培养基, 最佳不定芽诱导分化培养基: MS+5.0 mg·L-1 6-BA+0.3 mg·L-1 NAA;
最佳继代增殖培养基: MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IAA+20 g·L-1蔗糖, 不定芽的增殖倍数为2.7; 最佳生根培养基:
1/2MS+1.0 mg·L-1 IAA+20 g·L-1蔗糖, 生根率达100%, 平均生根数达5.7条。炼苗后移入珍珠岩、蛭石、草炭等体积混合的
基质中, 20 d后移栽成活率达60%。
关键词: 苹果砧木; ‘青砧一号’; 不定芽分化; 再生
Establishment of Efficient in vitro Regeneration System of Apple Rootstock
‘QZ-1’ (Malus hupehensis×M. domestica)
WU Rui-Gang1,2, YANG Hong-Qiang1,2,*, SHA Guang-Li3, YANG Ping-Ping1,2, BI Run-Xia1,2
1College of Horticulture Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Tai’an, Shandong 271018, China; 2State
Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an, Shandong 271018, China; 3Fruit Institute, Qingdao Academy of Agricultural Sciences,
Qingdao, Shandong 266100, China
Abstract: ‘QZ-1’ (Malus hupehensis×M. domestica) is a new strain of apple dwarfing rootstocks created by
hybridization. In this experiment, the factors influencing leaf regeneration of ‘QZ-1’ were studied and the
efficient in vitro regeneration system of ‘QZ-1’ was established. The results showed that MS medium with 0.3
mg·L-1 NAA and 5.0 mg·L-1 6-BA was optimal for adventitious bud differentiation. The best medium for
subculture proliferation was MS supplemented with 1.0 mg·L-1 6-BA, 0.1 mg·L-1 IAA and 20 g·L-1 sucrose, and
the proliferation times of adventitious buds reached 2.7 on it. 1/2MS medium containing 1.0 mg·L-1 IAA and 20
g·L-1 sucrose was the most suitable for rooting. The rooting rate was up to 100%, and the average number of
rooting reached 5.7. After acclimatization, the regenerated plants were transplanted into the matrix, which
contained perlite, vermiculite and peat (1:1:1, V:V:V). The survival rate was up to 60% after 20 d.
Key words: apple rootstock; ‘QZ-1’; adventitious bud differentiation; regeneration
优良砧木对增强果树抗逆性、控制树体生长
势、促进果树优质高产等具有重要意义。目前,
我国生产中应用的苹果砧木主要是实生繁殖的八
棱海棠、新疆野苹果、山定子等, 它们个体分离
严重, 嫁接品种后植株间差异大, 对果园整齐度、
单位面积产量和果实品质等有许多不利影响(赵晓
光2005); 平邑甜茶为具有高度无融合生殖能力的
湖北海棠的一个类型, 与苹果品种嫁接亲和性好,
根系发达, 实生后代及其嫁接植株生长发育比较
整齐, 但不具备矮化性能(沙广利2007; Yang等
2008)。‘青砧一号’是青岛市农业科学研究院和山
东农业大学以平邑甜茶为母本、以柱型苹果株系
CO为父本杂交育成的苹果砧木新品系, 除具备平
邑甜茶的优良性状外, 还有优良的矮化性能(沙广
利2010), 但其对环境的适应性还需进一步改良。
转基因技术是改良作物遗传性状的有效手段, 而
利用转基因技术改良作物通常需要先建立离体再
生和遗传转化体系。小金海棠(王忆2005)、八棱
海棠(朱文碧等2010)、山定子(武姣等2008)等我国
特有苹果砧木的遗传转化体系已陆续建立, 但目
前还缺乏无融合生殖砧木的离体再生和遗传转化
植物生理学报1054
技术, 对于‘青砧一号’离体再生的研究尚未见报
道。本研究以‘青砧一号’叶片为外植体, 建立其高
效离体再生体系, 为‘青砧一号’砧木的扩繁、遗传
转化体系建立及其性状改良提供技术支撑。
材料与方法
1 外植体来源
试验所用‘青砧一号’ (Malus hupehensis×M.
domestica)种子来自青岛市农业科学研究院果茶研
究所。2010年春季于4 ℃的条件下层积处理30 d后
在温室播种培养, 25~30 d后, 从生长健壮、无病虫
害的苗上剪取顶端叶片作为外植体进行组织培养
研究。
2 外植体处理
用洗洁精将叶片清洗后, 在流水下冲洗30 min
左右; 然后在超净工作台上分别用75%的酒精和
1 g·L-1的升汞溶液消毒30 s和8 min, 再用无菌水冲
洗3~5次; 随后将叶片放在无菌滤纸上, 用手术刀
切除叶缘和叶尖, 将其切成叶块状, 均匀接种到培
养基上。
3 培养基与培养条件
基本培养基为MS。不定芽分化培养基为 :
MS+6-BA+NAA, 其中, 6-BA的浓度处理为4.0、
5.0、6.0 mg·L-1, NAA的浓度处理为0.1、0.2、
0.3、0.5 mg·L-1。在培养基上接种50 d以后统计不
定芽的形成情况。
将再生不定芽转入继代增殖培养基上。继代
增殖培养基为: MS+6-BA+0.1 mg·L-1 IAA或IBA,
其中6-BA浓度为0.5和1.0 mg·L-1。生根培养基为:
1/2MS+1.0 mg·L-1 IAA或IBA+20 g·L-1蔗糖+6 g·L-1
琼脂, 50 d以后统计试管苗的生根情况。
除特别注明外, 上述培养基中均添加3%的蔗
糖和6.5 g·L-1琼脂, 加入琼脂后用2 mol·L-1 NaOH调
整pH值至5.8, 灭菌温度为121 ℃, 灭菌时间为20
min。培养条件为光周期16 h/8 h (光/暗), 光照强
度50 µmol·m-2·s-1, 温度(24±2) ℃。暗培养14 d后转
移至光下培养。50 d以后统计不定芽诱导率和平
均再生芽数: 再生频率(%)=再生不定芽的叶片数/
接种的叶片数×100; 叶片平均再生芽数(个)=再生
芽总数/再生芽的叶片数。培养30 d时统计增殖倍
数=总芽数/起始接种芽数。
4 炼苗与移栽
生根培养50 d后, 将完整试管苗带瓶转移到培
养温度相同、空气湿度较高的温室中, 打开瓶口,
使嫩苗逐渐与外界接触; 1周后用镊子把苗从培养
瓶中取出, 用流水将根部的培养基冲洗干净, 然后
移栽到已消毒的珍珠岩、蛭石、草炭等体积混合
的栽培基质中。移栽后每隔2~3 d向幼苗喷施一次
营养液, 在移栽的前7 d内保持适度遮荫及喷水保
湿, 20 d后统计成活率。
实验结果
1 NAA和6-BA对不定芽分化的影响
如表1所示, 在含有NAA和6-BA的培养基中,
表1 NAA和6-BA对‘青砧一号’不定芽分化的影响
Table 1 Effect of NAA and 6-BA on the adventitious bud differentiation of ‘QZ-1’ rootstock
植物生长调节剂浓度/mg·L-1 接种数/个 再生频率/% 叶片平均再生芽数/个
6-BA NAA
4.0 0.1 20 0 0
4.0 0.2 20 0 0
4.0 0.3 20 30 1.5
4.0 0.5 20 0 0
5.0 0.1 20 0 0
5.0 0.2 20 40 1.5
5.0 0.3 20 70 1.9
5.0 0.5 20 0 0
6.0 0.1 20 0 0
6.0 0.2 20 10 1.0
6.0 0.3 20 20 1.5
6.0 0.5 20 45 1.2
吴瑞刚等: 苹果砧木‘青砧一号’离体高效再生体系的建立 1055
当NAA浓度为0.1 mg·L-1时, 叶片的再生频率为0,
均无不定芽产生; 当NAA浓度为0.1~0.3 mg·L-1时,
随着NAA浓度的增加, 叶片再生频率不断提高;
NAA浓度为0.5 mg·L-1时, 再生频率有所下降。另
外, 当NAA浓度一定时, 叶片再生频率随着6-BA浓
度的增加呈现先升高后降低的趋势, 当6-BA浓度
处于5.0 mg·L-1时, 再生频率最高。因此, 诱导‘青砧
一号’不定芽分化最适宜的浓度配比为NAA 0.3
mg·L-1和6-BA 5.0 mg·L-1。按此配比, 经14 d暗培养
转至光下再培养20 d后, 在切割的伤口处出现绿色
不定芽(图1-A)。
2 6-BA、IBA和IAA三者配比对不定芽继代增殖
的影响
将诱导分化的不定芽分别放入不同的继代增
殖培养基中进行增殖培养, 如表2所示, 当6-BA浓
度为0.5 mg·L-1时, 不定芽增殖倍数为1.57~1.77; 当
浓度增加到1.0 mg·L-1时, 增殖倍数增至1.97~2.7。
在附加相同浓度的6-BA时, IAA促进增殖的效果
要优于IBA。当培养基中附加1.0 mg·L-1 6-BA+0.1
mg·L-1 IAA时, 不定芽增殖倍数最高, 达2.7。在此
条件下, 经过不定芽继代增殖培养, 得到长势良好
的无菌不定芽增殖材料(图1-B)。
3 生根培养与移栽
从上述再生无菌增殖材料中剪取2 cm以上的
植株, 分别转移至2种不同的生根培养基上。30 d
后, 根原基开始形成; 50 d后, 根系分布均匀、分
散。其中, 当IBA浓度为1.0 mg·L-1时, 生根率可高
达60%, 平均生根数为2.33; 当IAA浓度为1.0 mg·L-1
时, 生根率为100%, 平均生根数为5.7 (表3)。根据
生根率、平均生根数、根系生长发育及分布状况
等因素综合考虑, 附加1.0 mg·L-1 IAA培养基的生
根效果最优(图1-C)。将生根的试管苗移栽后20 d,
成活率达60%; 30 d后移栽苗在常规条件下正常生
长(图1-D)。
图1 ‘青砧一号’叶片离体再生体系
Fig.1 Regeneration system of leaves of ‘QZ-1’
A: 不定芽诱导分化50 d; B: 继代增殖培养30 d; C: 生根培养50 d; D: 再生植株的移栽。
植物生理学报1056
表3 IAA和IBA对‘青砧一号’再生植株生根的影响
Table 3 Effect of IAA and IBA on the rooting of regenerated ‘QZ-1’ plant
植物生长调节剂浓度/mg·L-1 植株数/个 生根的植株数/个 生根总数/条 生根率/% 平均生根数/条
IAA IBA
1.0 0 20 20 114 100 5.70
0 1.0 20 12 28 60 2.33
表2 植物生长调节剂对‘青砧一号’不定芽增殖的影响
Table 2 Effect of plant growth regulators on adventitious bud
proliferation of ‘QZ-1’ rootstock
植物生长调节剂浓度/mg·L-1 增殖倍数
6-BA IBA IAA
1.0 0 0.1 2.70a
1.0 0.1 0 1.97b
0.5 0 0.1 1.77b
0.5 0.1 0 1.57b
　　数据后不同字母表示5%水平差异显著。
讨　　论
良好的再生系统是决定作物遗传转化成败的
关键, 离体再生困难已成为苹果砧木转化频率低
的主要原因之一。不过, 由于苹果属植物叶片间
隙大, 其细胞易于诱导分化出不定芽, 并且通过叶
片再生不定芽获得再生植株周期短, 体细胞的无
性系变异小, 一旦建立起再生体系, 会有助于转基
因的成功(臧运祥等2004), 这也是本研究选择‘青
砧一号’离体叶片为外植体进行再生研究的出发点
之一。在苹果砧木叶片直接诱导再生不定芽的试
验中, 大部分采用了高浓度细胞分裂素(如3.0~6.0
mg·L-1的6-BA)与低浓度生长素(如0.2~1.0 mg·L-1的
NAA)配比来诱导叶片再生(王艳等2004)。本研究
则采用一步再生法, 通过在基本培养基上附加5.0
mg·L-1 6-BA与0.3 mg·L-1 NAA, 使‘青砧一号’离体
叶片不定芽再生频率达到70% (表1)。
无融合生殖实生矮化砧木是一类兼具无融合
生殖、矮化和实生后代稳定等特性的砧木, 培育
这类砧木是今后苹果砧木育种的一个重要方向,
目前主要采用实生选择、诱变或杂交等方法(赵晓
光和潘增光2002)。本研究选择无融合生殖实生矮
化砧木‘青砧一号’, 从离体叶片的不定芽诱导分
化、继代增殖、试管苗诱导生根和炼苗移栽, 建
立起完整的高效离体再生体系, 不仅有助于‘青砧
一号’的快速繁殖和遗传改良, 也为建立培育无融
合生殖实生矮化砧木的新方法提供了参考。
参考文献
沙广利(2007). 苹果无融合生殖矮化种质创新[学位论文]. 泰安: 山
东农业大学
沙广利(2010-10-26). 苹果砧木新品系——‘青砧一号’. 河北科技
报, 第B06版
王艳, 孙仲序, 夏阳(2004). 苹果砧木品种试管苗叶片再生体系的建
立. 山东农业大学学报(自然科学版), 35 (2): 196~200
王忆(2005). 苹果再生体系的建立与Mxlrt1基因功能的初步研究
[学位论文]. 北京: 中国农业大学
武姣, 孔瑾, 王忆, 韩振海, 许雪峰(2008). 发根农杆菌介导山定子遗
传转化及发根再生植株. 园艺学报, 35 (7): 959~966
臧运祥, 郑伟尉, 孙仲序, 达克东(2004). 苹果叶片组培再生系统研
究进展. 生物技术通报, (2): 15~18
赵晓光(2005). 平邑甜茶在苹果砧木育种及栽培中的价值. 安徽农
业科学, 33 (2): 265
赵晓光, 潘增光(2002). 我国无融合生殖类型的苹果属资源及其利
用. 山东林业科技, (3): 31~33
朱文碧, 刘海学, 黄俊轩, 李建科, 武春霞, 杨静慧(2010). 八棱海棠
转PuN HA基因的遗传转化研究. 北方园艺, (4): 121~124
Yang HQ, Duan KX, Zhang W (2008). Biology and physiology of
Malus hupehensis for the apogamic plant resource. Acta Hort,
769: 441~447