全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 7期, 2010年 7月 719
收稿 2010-03-30 修定 　2010-06-11
致谢 邢更妹研究员在设计本实验过程中进行了有益讨论。
* 通讯作者(E-mail: dongyh@ihep.ac.cn; Tel: 010-88233090)。
水溶性纳米量子点在玉米幼根中运输的可视化
徐建华 1, 高愈希 1, 赵甲庭 1, 李雅 2, 潘琛 2, 刘志宇 3, 董宇辉 1,*
1中国科学院高能物理研究所多学科中心, 北京 100049; 2北京林业大学生物科学与技术学院, 北京 100083; 3中国科学院生
物物理研究所计算与系统生物学研究中心, 北京 100101
提要: 在纳米生物学效应研究中, 纳米颗粒能否自由进入植物体内是一个亟待考证的关键问题。本文尝试采用一定浓度的
水溶性纳米量子点溶液培养玉米幼根, 然后徒手切片, 用荧光显微镜直接观察发光量子点在根内的运输和分布。结果表明,
量子点能够自由进入玉米根且在多种类型的细胞内都有分布; 尤其是在导管内也观察到量子点, 说明这种纳米材料能够穿
透极厚的细胞壁输送到胞内。本文也讨论了该实验设计的优缺点。
关键词: 量子点; 可视化; 玉米根; 运输
Visualization for Water-Soluble Nano Quantum Dots Transporting in Maize
(Zea mays L.) Seedling Roots
XU Jian-Hua1, GAO Yu-Xi1, ZHAO Jia-Ting1, LI Ya2, PAN Chen2, LIU Zhi-Yu3, DONG Yu-Hui1,*
1Center for Multi-Disciplinary Research, Institute of High Energy Physics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
2College of Biological Science and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 3Center for Computational and
Systems Biology, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
Abstract: In the study of nano-biological effect, it is urgent to find evidence for that if nanoparticles can
transport into a plant freely. In this paper, maize seedlings are cultured in Hogland’s neutrient liquid containing
water-soluble quantum dot. Five days later, the seedling roots are sliced by hands and watched by fluorescence
microscopy in real time. Results show that the quantum dots can transport freely into the maize roots and
distribute in various type cells, especially in the vessel cell, indicating the nanoparticles can penetrate through the
extreme thick cell wall and transport into the cells. We also discuss the advantages and disadvantages of this
experimental design.
Key words: quantum dot; visualization; maize root; transport
纳米颗粒指的是物理特征长度取在100 nm以
内的物质颗粒。由于这个尺度的颗粒处于过渡区,
介于单个原子 /分子和体相物质之间, 改变了物质
的物化性质, 如表现出超导性、表面活性和光敏
性, 因而引起人们的极大关注(Bai 2005; Biscas和
Wu 2005)。近年来, 纳米材料的研究与应用迅猛
发展, 成为当今新材料研究领域中最富有活力、对
未来经济和社会发展有着重要影响的研究方向。
迄今为止, 纳米材料已经广泛应用到物理、化学、
生物、医学、能源和环境等各个领域。可以说
纳米材料和纳米科技已经渗透到人类生活的方方面
面, 其中特别值得一提的是纳米材料和纳米科技对
生物学领域产生的冲击与影响。考虑到百余年来
科技发展的“双刃剑”效应, 纳米科技兴起不久, 纳
米生物学效应的研究就随之起步(Meng等 2007;
Chen等 2007)。按照生物学研究的发展规律, 近年
来起步的纳米生物学效应研究目前集中在动物领
域。原因有二, 一是人类对自身健康安全的关注;
二是动物学的研究相对容易和直观, 如可以通过静
脉注射和口腔饲喂, 使材料进入动物体内, 所产生
的效应也便于观察。与此相对应, 由于植物与人类
的亲缘较远; 另外, 植物厚而坚硬的细胞壁使材料
进入植物体非常困难, 诸多方面的原因导致纳米生
物学效应在植物领域的研究相对滞后。往往是动
物模型先建立起来, 发展成熟后才考虑到应用于植
物学研究中。
由于植物结构的特殊性, 既每个细胞都有细胞
壁, 开展纳米植物学研究, 人们比较感兴趣的一个
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基本问题就是: 纳米材料能自由进入到植物体内
吗？其实, 这也是今后整个纳米植物学研究的很关
键的一环。植物生长环境中有纳米材料, 即便未进
入植物体也会导致植物细胞形态、结构和功能的
改变; 但是, 如果经实验证实纳米量级的颗粒跨越
层层细胞壁进入到植物体内, 那么, 除了众所周知
的应用意义外, 其理论意义更为引人注目。因为通
常来讲, 植物根只能以离子形式从土壤中吸收水分
及养料, 而纳米颗粒过于 “巨大”, 难以进入具有密
实坚硬厚壁之细胞内, 若经证实纳米颗粒能自由进
入到细胞内, 一些传统的细胞生物学、生理学理论
将面临挑战。从已经发表的结果看, 研究者们以多
种技术手段论证纳米颗粒对植物体生长产生了或正
或负的影响, 如, Zheng等(2005)指出纳米二氧化硅
和纳米二氧化钛的混合物在合适的浓度下纳米二氧
化钛可以促进光合作用和固氮机制并大大加快菠菜
的生长。Yang和Watts (2005)总结出没有包被的
铝微粒抑制玉米、黄瓜、大豆、卷心菜和胡萝
卜根的伸长。问题是, 产生影响的原因是纳米颗粒
释放到溶液中的离子还是纳米颗粒进入到植物体内
导致的？迄今有限的几项研究对这个问题没有明确
的、令人信服的回答。仅有的一篇论文用双光子
显微技术观察到纳米管两端刺破根的表皮细胞, 暗
示纳米材料可能进入到细胞内部(Wild和 Jones
2009)。但仍缺乏足够的证据。本论文仅从这个
角度出发, 设计一个简单直观的实验来试图解决这
个问题, 并尝试从植物细胞解剖结构特点来阐释得
到的结果。该实验是: 利用应用广泛的兼具纳米材
料特点和荧光标记功能的量子点, 选择模式植物玉
米幼苗, 采用徒手切片技术以便活体成像观察, 结
果在荧光显微镜下直接看到纳米材料不但能输送到
植物幼根内, 而且在多种细胞内均有分布。
材料与方法
1 纳米材料
实验中应用的水溶性量子点(CdSeS, 带羟基)
从天津游瑞量子点技术发展有限公司购买。其激
发波长 478 nm, 发射波长 614 nm, 半峰宽 42 nm,
pH 大于 7。
2 种子
选择的模式植物为玉米(Zea mays L.), 一则玉
米是USEPA (美国环境保护署)推荐作为研究农药
和有毒物质生态效应的植物; 二则玉米幼根直径较
大, 适于徒手切片以便活体观察, 尤其是其构成细
胞也大, 便于在光镜下实时观察纳米量子点的分布
位置。种子发芽率大于 85%, 从北京市密云县种
子公司购买, 品种为 ‘农大 3138’, 使用前保存在室
温下干燥黑暗的环境中。
3 培养溶液的制备
培养液使用改良的霍格兰配方。将量子点原
液用培养液稀释至浓度分别为 5 mg·L-1和 10 mg·L-1,
实验完成后用动态光散射技术测定其在玉米生长液
中的粒径大小多为大于 10 nm的团状颗粒。
4 发芽
将种子浸泡在15%的氯化钠溶液里15 min灭
菌, 用自来水流水冲洗 6 h, 再经去离子水冲洗 3次
后, 将玉米种子放进垫有滤纸的培养皿中, 种子间
隔约为 1 cm, 置于人工气候箱内培养。培养箱温
度 25 ℃, 黑暗条件, 湿度 80%。芽长大概有 1~2
cm时转至上述配制好的营养液中继续培养 5~7 d,
根长10 cm左右时可以进行徒手切片用于荧光显微
镜观察。
5 样品的制备
将玉米幼根先用自来水冲洗, 再用超声波清洗
1 min, 然后蒸馏水反复冲洗几次后用一次性刀片徒
手切片, 马上置于荧光显微镜观察。中科院生物物
理所的荧光显微镜型号是: Zeiss Observer A1; 物镜:
A-plan 10×/0.25 Ph1 Plan-APOCHROMAT 63×/1.4
Oil DIC; 相机: ANDOR iXon EM+; 图像软件:
MetaMorph。图中蓝、绿色等背景衬底颜色是用
软件添加的伪彩。
结果与讨论
绿光激发下, 量子点显示为红色, 以此标记植
物体是否将培养液中的量子点吸收到体内及其在各
种细胞内的输送。植物根部的解剖结构较为复杂,
大体分为表皮、皮层(又称外皮层, 由薄壁组织细
胞构成)和内皮层中柱(由内皮层细胞、导管和薄
壁细胞等构成)。首先, 观察最外层的根表皮细胞
吸收量子点的状况(图1-A~C): 与对照样品(图1-A)
相比, 图 1-B (量子点浓度 5 mg·L-1)中观察到根表
皮细胞有较厚层的红色, 表明该部位吸附很多量子
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图 1 量子点在玉米根中的分布
Fig.1 Distribution of quantum dots in maize root
A~C: 两种浓度的量子点在玉米根中的分布。A为对照; B和 C分别为浓度 5 mg·L-1和 10 mg·L-1量子点溶液中的玉米幼根切片,
B示根表皮细胞粘附大量的量子点颗粒, 而 C 则无。D 和 E: 玉米根内皮层内外量子点的分布。D 示 5 mg·L -1量子点在皮层(外皮
层)的分布; E示内皮层中柱导管之间的细胞中的量子点, 具体位置见 E1, 左下图为 E1 放大图。F (F1和 F2): 玉米根内皮层中柱内的
量子点分布。F示 5 mg·L-1量子点在内皮层中柱薄壁细胞和导管细胞内的分布; F1示导管细胞壁上量子点的具体位置, 右上图为 F1
放大图; F2 示薄壁细胞内核包被大量量子点, 右下图为 F2 放大图。
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点; 相反, 图 1-C (量子点浓度 10 mg·L-1)则与对照
样品完全一样, 未观察到量子点的存在。该结果证
明: 第一, 浓度不同, 细胞对量子点的吸收不同; 第
二, 说明图1-B中根表皮细胞与量子点的结合不是
简单的 “靠近 ”, 而是有紧密的相互作用。由于显
微镜的分辨率有限, 图1-B很难辨别出植物根对量
子点是物理性的黏附还是已经渗透到细胞表皮内。
为此, 我们采用的方法是超声波清洗 3次, 每次
30~50 s。清洗前, 这两种浓度的根表面都有红颜
色, 说明都粘有培养液中的量子点; 经过反复超声
清洗后, 5 mg·L-1样品细胞仍有大量的量子点, 而
10 mg·L-1样品则被清洗干净。因此, 可以初步认
为, 5 mg·L-1量子点进入表皮细胞壁, 至少与表皮细
胞发生了紧密的联系, 不是简单的附着。关于 10
mg·L-1浓度的量子点没有进入到植物体内的原因,
可能是浓度过高, 纳米颗粒在营养液多种离子的共
同作用下黏附在一起形成大的团块, 从而导致无法
通过根表皮细胞的空隙进入根内的缘故。
其次, 位于表皮内的皮层薄壁组织细胞中观察
到均匀分布的大量量子点(图 1-D、E)。再向内,
内皮层中柱薄壁细胞中的量子点开始变得稀薄(图
1-E方框内), 其红色亮度微弱, 需要局部放大图片
方清晰可见(图 1-E1放大图)。最后或者称根最内
层的导管细胞内则更为稀少而难以辨认(图 1-F和
F1), 经局部放大仍勉强可见(图 1-F1)。根部吸收
营养物质的输送路线由外至内为: 表皮→皮层细胞
→内皮层中柱薄壁细胞→内皮层导管细胞, 经由导
管细胞将物质向上运输到茎叶供生长发育需要。
不难理解, 物质越向内运输, 遇到的阻力就越大; 而
实验结果与该理论推测也完全吻合。唯一的例外
是中柱薄壁细胞中一个正在进行有丝分裂的细胞
核, 完全被量子点包被(图 1-F2), 红色亮度强而醒
目, 暗示生殖分裂时期的细胞对该量子点的吸收能
力极强。可以推测, 处于繁殖时期的细胞对外界纳
米颗粒的吸收强于营养生长期。当今纳米材料遍
及生活方方面面, 该结果对农作物培育以及农产品
的安全性提出警示。
虽然用量子点能直观地看到其在根各层细胞
中的分布状态, 但这简单直观的实验结果背后尚有
许多问题需要阐明。
一是用于该实验的量子点经过羟基化处理, 目
的是使这种有荧光标记作用的纳米材料溶于水以便
混合在植物培养液中, 以解决纳米材料不溶于水的
问题。但是, 羟基化处理后的纳米材料, 其表面像
穿上了一件厚厚的外套, 在跨越各层细胞壁进入到
细胞内时的输送机理、物化性质等都可能会有所
不同, 不能完全等同于未经羟基化处理的量子点, 这
是该实验设计追求直观简单必须付出的一个代价。
那么, 穿上 “厚外套 ” (羟基)、体积增大很多的纳
米量子点是如何跨越根部层层障碍进入到植物体内
部的？
按Steudle和Peterson (1998)的“根复合输导模
型 ”理论, 其输送物质的途径有两种: 选择性较高
的共质体途径(protoplast path)和选择性较低的质外
体途径(apoplast path)。前者只容水分及无机离子
通过, 用于本实验的量子点较之水分子和离子体积
“巨大 ”, 只能通过质外体途径, 即穿越细胞间隙和
细胞间的通道纹孔等进入细胞内部。据作者以往
对根结构及输水功能的研究(徐建华 2000; 徐建华
等 2002, 2006), 玉米根细胞间的纹孔较大, 孔径达
200 nm, 显然有利于量子点的输送。由于已经进
入到物质输送的主要通道导管中, 可以推测, 植物
茎和叶中也应该有量子点的分布。
另外一个要重点讨论的是植物样品的培养和
处理, 如前文说过, 这也是植物实验较之动物实验
最难以克服的一个技术难点, 而每一个步骤的处理
都可能直接影响到结果。Lin和Xing (2007, 2008)
提到, 在实验过程中使用氧气泵为培养液供氧, 但
这样做的一个弊端是可能造成幼小植物根的机械损
伤, 尤其是细小根毛只由数个细胞构成, 极易受损;
Lee等(2008)为克服纳米材料不溶及在溶液中分布
不均、聚合等问题而采用凝胶固体培养, 既为植物
提供充分的养料, 又巧妙地固定了不溶纳米材料, 值
得推广; 本文实验为避免幼根损伤, 用小烧杯培养
幼苗, 在观察前不移动幼苗, 可避免机械损伤, 但可
能会导致一定程度的缺氧。
关于纳米材料的选择, 也多种多样, 但作者建
议尽量选择惰性较强、化学性质不活泼的纳米材
料, 如果在溶液中有解离等现象, 对结果的解释就
变得复杂起来。
总之, 本论文是一次尝试性的研究, 将实验的
重点放在: 第一, 纳米颗粒能够自由进入到植物体
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内的事实被可视化, 这是最直接有力的证据; 第二,
活体观察, 这是生物学研究者所追求的最高境界; 第
三, 简单易行。若达到以上要求, 难免在其他方面
做出牺牲和让步, 因此实验结果仍有待进一步的、
多方面的论证。
参考文献
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