全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (12): 1167~1172 1167
收稿 2012-09-17　　修定 2012-11-15
资助 国家自然科学基金(30771297)和广东省自然科学基金
(06025049和10251063101000010)。
* 共同第一作者。
** 通讯作者 (E-mail: liling502@126.com; Tel: 020-85211378)。
超表达AhNCED1拟南芥植株在渗透胁迫下抗氧化能力和抗旱相关下游
基因表达变化
李嘉怡1,*, 苏良辰1,2,*, 何月容1, 李玲1,**, 唐慧玲1, 吴嘉莉1
1华南师范大学生命科学学院, 广东省植物发育生物工程重点实验室, 广州510631; 2遵义医学院珠海校区生物工程系, 广东
珠海519041
摘要: 利用纯系超表达AhNCED1拟南芥植株, 在添加300 mmol·L-1山梨醇的MS培养基上胁迫培养, 分析其表型及抗氧化能
力。结果表明, 在正常情况及300 mmol·L-1山梨醇处理10 d条件下, 与129B08/nced3突变体和野生型比较, 超表达AhNCED1
植株生长状况好, 主根长度增加, 幼苗体内O2·ˉ含量水平较低, POD和SOD酶活性较高。说明NCED1基因对于拟南芥体内抗
氧化酶系统的维持有重要意义。用sqRT-PCR方法检测结果表明, 野生型和超表达AhNCED1拟南芥植物体内KIN1、COR47
和RAB18基因表达随脱水延长而明显增强, 且在超表达AhNCED1拟南芥中增强幅度大。
关键词: 超表达AhNCED1; 拟南芥; 渗透胁迫; 抗氧化水平; 基因表达
Antioxidant Activity and Expression of Downstream Genes Related with
Drought Resistance in Transgenic AhNCED1 Arabidopsis under Osmotic Stress
LI Jia-Yi1,*, SU Liang-Chen1,2,*, HE Yue-Rong1, LI Ling1,**, TANG Hui-Ling1, WU Jia-Li1
1Guangdong Key Lab of Biotechnology for Plant Development, College of Life Sciences, South China Normal University, Guang-
zhou 510631, China; 2Department of Biological Engineering of Zunyi Medical College Zhuhai Campus, Zhuhai, Guangdong
519041, China
Abstract: Pure line of over-expressed AhNCED1 plants were planted on MS culture medium with 300
mmol·L-1 sorbitol, and the antioxidant activity and their phenotype were analyzed. The results showed that, both
in normal conditions and treated by 300 mmol·L-1 sorbitol, over-expressed AhNCED1 plants were growing
better than 129B08/nced3 mutant and wild type, while the main root lengths of over-expressed AhNCED1
plants were longer than them when planted 10 d. In the meanwhile, over-expressed AhNCED1 plants had lower
O2·ˉ content level than Col-0 and 129B08/nced3 mutant, and SOD and POD activities were higher. The results
showed that the NCED1 gene played an important role in maintaining the antioxidant enzymes system. It could
be well studied by sqRT-PCR that the expression of KIN1, COR47 and RAB18 were increasing under the early
dehydration treatment in Col-0 and the over-expressed AhNCED1 plants, while it was markedly increasing in
over-expressed AhNCED1 plants.
Key words: over-expressed AhNCED1 gene; Arabidopsis; osmotic stress; antioxidant activity; gene expression
脱落酸(ABA)参与了植物如种子萌发、幼苗
生长等重要生长和发育过程, 是植物重要抗逆境
信号因子。在干旱胁迫下植物体内ABA含量提高,
可诱导植物体内多种下游基因的表达 , 如引起
RD29A和RD29B (Baker等1994)、P5CS (Székely等
2008)、KIN1 (Xiong等2002)等相关基因的表达水
平提高, 与植物的抗旱性表现为正相关(Xiong等
2002)。P5CS和KIN1能够在脱水和ABA处理的条
件下快速响应积累, 与渗透胁迫反应过程密切相
关(Kurkela和Franck 1990)。
9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxy
carotenoid dioxygenase, NCED)是调节ABA生物合
成的关键限速酶(Nambara和Marion-Poll 2005)。植
物体内NCED表达水平与ABA含量呈现正相关
(Burbidge等1999; Christmann等2005)。将T-DNA
插入到拟南芥AtNCED3基因(At3g14440)外显子获
得129B08/nced3突变体, 该突变体在水分胁迫下不
植物生理学报1168
能积累ABA, 对水分胁迫敏感(Christmann等2005)。
本实验室在2005年从干旱诱导的耐旱花生中
克隆得到AhNCED1 (Arachis hypogaea nine-cis-ep-
oxycarotenoid dioxygenase), 证明其具有NCED基因
功能(Wan和Li 2005), 并成功转入拟南芥影响抗旱
性, 转基因拟南芥在甘露醇的渗透胁迫下具有较
高的萌发率和较强的抗失水能力(Wan和Li 2006)。
但该基因在拟南芥的超表达是否影响植株的抗氧
化水平, 以及与ABA响应相关基因表达的关系尚
不清楚。本实验使用300 mmol·L-1山梨醇对超表达
AhNCED1拟南芥进行渗透胁迫, 与129B08/nced3
突变体和哥伦比亚野生型(Col-0)相比较, 分析植株
的抗渗透胁迫能力和ABA响应的抗旱相关下游基
因表达, 探讨AhNCED1基因对植物抗氧化水平和
抗旱基因表达的影响以及机理 , 为全面认识
AhNCED1功能提供新的依据。
材料与方法
129B08/nced3突变体(Col-0遗传背景)、哥伦
比亚生态型野生型拟南芥(Col-0, Arabidopsis thali-
ana L.)和纯合AhNCED1 (35S::AhNCED1, Col-0遗
传背景)转基因拟南芥种子由本课题组保存。将消
毒后的种子分别均匀分散于1/2MS培养基中, 4 ℃
春化3 d后, 置于22~24 ℃、相对湿度60%~70%、
光强150 μmol·m-2·s-1、日照长度为16 h的条件下培
养10 d。将4~6叶幼苗移至含300 mmol·L-1山梨醇
培养基中, 黑暗8 h培养。以未处理转基因拟南芥
幼苗为对照。取八叶期拟南芥幼苗移出土, 清水
浸泡冲洗干净。用吸水纸将不同种拟南芥上水分
全部吸干, 置于22 ℃、相对湿度60%、16 h光照/
8 h黑暗的条件下自然脱水, 处理时间分别为0、
0.5、1.0和2.0 h。
参照Wan和Li (2005)的方法: 取T1代的种子播
种于含25 µg·mL-1潮霉素的固体筛选培养基上。挑
选存活植株移栽至已灭菌的土壤中, 植株生长至
莲座期时提取DNA, 采用花生AhNCED1基因特异
性引物GP1和GP2进行PCR扩增, 检测阳性结果。
观察培养10 d的植株, 使用Digimizar软件测定植株
主根根长 , 每个处理各统计20株材料。分别以
NBT光还原法(魏金凤等2009)和愈创木酚法(白宝
璋等1993)测定地上部分SOD和POD活性, 酶活性
以每毫克蛋白的酶单位数表示。同时将幼苗置入
1 mL 1% NBT染液的离心管中, 白炽灯下染色20
min, 用脱色液(冰醋酸:乙醇1:3)脱色3次, 每次30
min, 蒸馏水洗3次, 观察染色情况。
实验中计量资料以均数±标准差表示, 采用
SPSS13.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way
ANOVA), 方差齐性时采用LSD法(Least-Significant
Difference Test)进行组间均数比较, 方差不齐时采
用Welch进行校正分析, P<0.05为差异有统计学意
义。
用Trizol法提取拟南芥总RNA, 采用一步法
RT-PCR半定量基因的转录表达水平, 采用TAKA-
RA PrimeScript TM One Step RT-PCR Kit。引物ac-
tin-F和actin-R用于扩增拟南芥actin rRNA, 以做
PCR反应的内标。所有引物(表1)合成由上海英骏
生物公司完成。
实验结果
1 转基因AhNCED1拟南芥植株的分子鉴定
选择转基因T1代拟南芥植株进行PCR鉴定(图
1), 其中5、6、7、8号出现分子量为684 bp目标基
因的谱带, 鉴定为转基因超表达植株。取5号超表
达植物T3代株系, 用于后续实验研究。
图1 超表达AhNCED1拟南芥PCR鉴定
Fig.1 PCR identification of over-expressed AhNCED1 A.
thaliana
1: 负对照; 2: 正对照(质粒DNA); 3~8: 已检测AhNCED1超表
达植株DNA; M: DL2000。
2 超表达AhNCED1拟南芥植株抗渗透胁迫能力
种子在正常培养基培养10 d, 超表达AhNCED1
拟南芥的生长状况最好(图2), 主根长度较长, 叶片
生长较快。
在渗透胁迫条件下生长的129B08/nced3突变
体、Col-0和超表达AhNCED1拟南芥主根长度比
正常生长条件下分别减少了51.36%、51.94%和
40.86% (图3)。正常情况下, 129B08/nced3突变体
和Col-0的主根长比AhNCED1的要短; 在渗透胁迫
李嘉怡等: 超表达AhNCED1拟南芥植株在渗透胁迫下抗氧化能力和抗旱相关下游基因表达变化 1169
表1 拟南芥抗旱相关下游基因RT-PCR引物
Table 1 RT-PCR primers of downstream genes which related with drought resistance in Arabidopsis
引物名称 引物序列 扩增基因
actin-F GCTGAGAGATTCAGACTGCCCA 拟南芥actin基因
actin-R CACAGTTTTCGCGATCCAGAC 拟南芥actin基因
GP1 GTTCACGCCGTGAAATTCCACA 花生AhNCED1基因
GP2 GCGCTTCAATCCACCGGATACCA 花生AhNCED1基因
RD29A-F TGGAAAATGGATCAAACAGAGGAA 花生RD29A基因
RD29A-R TCAGTTCTCATATTCTTAAAGCTC 花生RD29A基因
RD29B-F GCTTTGGAAAATGGAGTCACAGT 花生RD29B基因
RD29B-R AACCCCAAATCTTCAGTTCCCAG 花生RD29B基因
Kin1-F TCTGAAAAAATGTCAGAGACCAAC 花生Kin1基因
Kin1-R AAATTTGACCCGAATCGCTACTTG 花生Kin1基因
P5CS1-F AGACGACGACGACGATAATGGAG 花生P5CS1基因
P5CS1-R AGAAGTTGAGCTGCCGTCACATC 花生P5CS1基因
RAB18-F GCTTAAGACAAGAAGAACATGGCG 花生RAB18基因
RAB18-R GGTGAAGCATTCCTCCCAAGCCA 花生RAB18基因
COR47-F GATTAACTATGGCTGAGGAGTACA 花生COR47基因
COR47-R CCTCCTACACACACAACTTACACA 花生COR47基因

图2 渗透胁迫下各株系拟南芥的生长表型
Fig.2 Phenotype of lines of A. thaliana under osmotic stress
MS: MS培养基; MS+Sor: 添加300 mmol·L-1山梨醇的MS培
养基。
条件下可观察到同样的现象, 说明超表达AhNCED1
拟南芥具有较强的生长能力。
3 超表达AhNCED1拟南芥植株抗氧化能力
图4结果显示, 渗透胁迫处理前129B08/nced3
突变体NBT染色较深于Col-0和超表达AhNCED1
拟南芥。渗透胁迫1 d, 突变体和野生型植株叶片
边缘色加深, 超表达拟南芥染色情况基本不变。
图3 渗透胁迫下超表达AhNCED1拟南芥主根长度
Fig.3 Length of main root of over-expressed AhNCED1 A.
thaliana under osmotic stress
不同小写字母表示不同品种拟南芥在不同测定值比较具有显
著性差异(P<0.05)。图5、6同此。
处理2 d后, 3个品种拟南芥植株根部均被染色, 其
中129B08/nced3突变体根部染色最深。处理3 d后,
129B08/nced3突变体叶片及茎部染色加深, 根部无
染色, Col-0和超表达AhNCED1拟南芥染色稍有加
深。处理第4天, 3个品种拟南芥几乎不被染色, 这
可能与第4天植物体内抗氧化酶活力上升有关系,
其中129B08/nced3突变体植株茎部带有红色, 叶片
边缘隐约有蓝色。处理第5天, 129B08/nced3突变
体整体出现黄色, 叶片染色仍然较深且集中于叶
片中部; Col-0整株均有染色, 但总体较浅; 超表达
AhNCED1拟南芥染色已恢复至处理前水平。
植物生理学报1170
正常条件下超表达AhNCED1拟南芥植株的
POD活性与129B08/nced3突变体和Col-0的活性没
有显著差异。渗透胁迫1 d后植株的酶活性显著下
降, 第2天显著升高, 随后酶活下降并维持在正常
水平, 但仍显著高于胁迫1 d时的酶活性; 其中, 超
表达AhNCED1和Col-0拟南芥POD活性于胁迫处
理第2天升幅显著, 分别为正常水平的6.95和3.65
倍(图5)。
正常条件下超表达AhNCED1拟南芥体内SOD
活性高于突变体和野生型。渗透胁迫处理1 d后,
129B08/nced3突变体SOD活性显著下降, 处理第2
天恢复至正常水平, 随后持续下降(图6); Col-0和
AhNCED1超表达植株均在处理后显著下降, 于第2
天开始逐渐上升。
4 超表达AhNCED1拟南芥植株抗旱相关下游基
因的表达
分析渗透胁迫下抗旱下游相关基因的表达发
现, RD29A在超表达AhNCED1植株、突变体和野
生型植株随着脱水时间延长表达量增加(图7),
RD29B在Col-0和超表达AhNCED1植株中表达无
显著变化, 在129B08/nced3中表达出现下降趋势;
在Col-0和超表达AhNCED1拟南芥中的KIN1表达
图5 渗透胁迫下超表达AhNCED1拟南芥POD活性变化
Fig.5 Change of POD activity of over-expressed AhNCED1 A. thaliana under osmotic stress
均逐步提高, 而在129B08/nced3中随着脱水处理延
长, 基因表达却逐渐下降; COR47和RAB18基因在
Col-0和超表达AhNCED1拟南芥中随脱水时间延
长表达提高显著, 而在129B08/nced3中随着脱水加
深基因表达提升不明显。
讨　　论
我们的前期研究结果表明, 在甘露醇渗透胁
迫的条件下, 超表达AhNCED1拟南芥具有较高的
萌发率(Wan和Li 2006)。本实验结果表明 , 与
图4 渗透胁迫下超表达AhNCED1拟南芥NBT染色
Fig.4 NBT staining of over-expressed AhNCED1 A. thaliana
under osmotic stress
李嘉怡等: 超表达AhNCED1拟南芥植株在渗透胁迫下抗氧化能力和抗旱相关下游基因表达变化 1171
129B08/nced3突变体和野生型幼苗相比, 超表达
AhNCED1拟南芥幼苗的根系发育速度快, 在渗透
胁迫条件下生存率高, 抗渗透能力明显。超表达
AhNCED1拟南芥无论在正常条件还是渗透胁迫处
理下, 体内O2·ˉ始终低于129B08/nced3突变体和野
生型, 说明其清除体内O2·ˉ的能力较强。本实验结
果也表明, 正常条件下超表达AhNCED1拟南芥
SOD和POD活性均高于野生型和129B08/nced3突
变体。有报道指出, SOD和POD共同作用能够有
效地清除植物体内的活性氧及其他过氧化物自由
基(Kar 2011)。超表达AhNCED1拟南芥的POD活
性在胁迫处理第4天出现小幅度上升, 而129B08/
nced3突变体胁迫处理3 d后SOD和POD活性分别
维持在22.5%~40%和55%~65%之间, 不能恢复至
正常水平, 与其NCED3基因缺失有关, 说明NCED
基因的存在与植物维持拟南芥体内过氧化酶系统
的稳定有关。
黎瑞敏等 ( 2 0 0 8 )指出干旱胁迫的条件下
AhNCED1转基因拟南芥植株比野生型植株矮壮,
侧根发生多, 根系发育好, 在正常培养及干旱条件
下, 叶片气孔开度和气孔密度均比野生型小, 认为
超表达AhNCED1植株可能通过增强植株体内ABA
含量, 影响气孔发育和开合来增强抵抗干旱的能
力。本实验结果表明, 在超表达AhNCED1拟南芥
中, KIN1、COR47和RAB18表达量高, 在渗透胁迫
条件下表达增强, 而这些基因在129B08/nced3突变
体中的表达提高不明显。目前认为, 植物对干旱
胁迫应答的基因调控网络, 通常分为ABA依赖与
非依赖两大调控网络(张洪霞和郭岩2012), 相关的
转录因子会随之调控不同下游基因的表达(Shino-
图6 渗透胁迫下超表达AhNCED1拟南芥SOD活性变化
Fig.6 Change of SOD activity of over-expressed AhNCED1 A. thaliana under osmotic stress
图7 Col-0、AhNCED1和129B08/nced3植株抗旱相关下游胁迫响应基因表达
Fig.7 Expression of stress induced gene which related with anti-drought in Col-0, AhNCED1 and 129B08/nced3
植物生理学报1172
zaki和Yamaguchi-Shinozaki 2000)。该结果可能与
在渗透胁迫条件下, 超表达AhNCED1拟南芥的抗
渗透胁迫能力提高, 植株体内NCED表达促进ABA
合成, 提高体内ABA依赖基因的表达增强相关。
总之, 超表达AhNCED1促进拟南芥的根系发
育, 提高体内抗氧化酶活性, 使植物体在渗透胁迫
下快速恢复并维持过氧化酶系统稳定, 诱导ABA
下游胁迫相关基因KIN1、COR47和RAB18的表达
增强, 影响了相关的生理生化反应, 促进植株抗胁
迫能力提高。AhNCED1基因可能通过提高植物体
内抗氧化酶活性和相关下游基因的表达增强植物
的抗旱性。
参考文献
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