全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (5): 511~517 511
收稿 2012-01-17　　修定 2012-04-13
资助 国家“863”计划子项目(2011AA100208)。
﹡ 通讯作者(E-mail: ypxia@zju.edu.cn; Tel: 0571-88982391)。
超低温保存植物种质资源的新途径——小滴玻璃化法
吴昀1, 张琳1, 林田2, 夏宜平1,﹡
1浙江大学农业与生物技术学院园林研究所, 杭州310058; 2上海市农业科学院农业生物基因中心, 上海201106
摘要: 超低温保存是一种安全、有效的种质资源保存途径, 可长期保存种质资源。小滴玻璃化法是在滴冻法和玻璃化法上
基础上发展起来的用于植物种质资源保存的新技术。本文综述了该方法的技术概念、主要优点、基本程序、应用前景及
国内外研究现状。
关键词: 小滴玻璃化法; 超低温保存; 种质资源
A Novel Approach for Cryopreservation of Plant Germplasm Resources—
Droplet-Vitrification
WU Yun1, ZHANG Lin1, LIN Tian2, XIA Yi-Ping1,﹡
1Institute of Landscape Architecture, College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China;
2Shanghai Agriculture and Biology Gene Center, Shanghai Academy of Agricultural Science, Shanghai 201106, China
Abstract: Cryopreservation is a safe and efficient method for germplasm conservation, which could be long-
term preservation. Droplet-vitrification technique is the newest method based on droplet-freezing method and
vitrification method for plant germplasm resources cryopreservation. The present paper primally reviewed the
concept, the major advantages, the basic procedure, the present research status at home and abroad, and applica-
tion prospect.
Key words: droplet-vitrification; cryopreservation; plant germplasm resources
1 超低温法保存植物种质资源
植物种质资源是植物遗传育种的原始材料,
但由于人口激增, 工业发展, 导致大量具备优良特
性的野生资源逐渐濒临灭绝, 从而失去了很多育
种中改良品种的宝贵材料。传统植物种质资源保
存的方法通常有以下几种: 一、原地保存及种质
圃保存, 二、建立种子库, 三、组培离体保存(梁永
恒等1999), 这些方法虽在资源保存方面发挥了重
要的作用, 但由于其占地面积大、成本高、易受
外界环境影响、不利于材料的国际交流等弊端,
不能长期稳定保存种质资源(王越和刘燕2006)。
而上世纪70年代初发展起来的超低温保存却弥补
了这方面的不足(Nag和Street 1973), 以最少的空间
和维护成本成为种质资源长期保存的一项重要途
径(Sakai和Engelmann 2007)。
超低温保存(cryopreservation)是离体保存与
低温生物学相结合的产物, 是指-80 ℃以下的极低
温度保存种质资源的一整套生物学技术(裴冬丽等
2005)。在超低温条件下(一般是液氮, -196 ℃), 几
乎所有的细胞代谢活动和生长过程都停止, 最大
程度地抑制了生理活动, 减少了遗传变异的发生,
从而保持了生物材料的稳定性。但此时的细胞仍
然具备活力和形态发生的潜能(Kartha和Engelmann
1994)。因而, 超低温保存是一种安全、有效的种
质资源保存途径, 尤其对于无性繁殖及顽拗性种
子植物的保存, 是唯一长期保存的途径。目前, 已
有超过200种植物成功确立了超低温保存程序(En-
glemann 2004)。保存材料主要有三种: 顽拗性及
营养繁殖作物、珍稀及濒危植物和具优良遗传资
源的栽培品种(Engelmann 2011)。自70年代初发展
起来的玻璃化法(Nag和Street 1973), 与传统超低温
保存法(慢冻法、二步法等) (Withers 1985, 1987)相
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学报512
比, 具有设备简单、程序简化和冻存效果好等优
点, 在保存器官和组织水平的结构完整性方面有
独到之处(王君晖和黄纯农1994), 最早由Rall和
Fahy (1985)成功冻存小鼠的胚胎, 这是玻璃化法在
动物材料上的首例报道。Uragami等(1989)用玻璃
化法保存了石刁柏体细胞胚; 同年, Langis等(1989)
冻存了蔓菁悬浮培养物, 开始了玻璃化法在植物
材料上的应用。目前, 玻璃化法已广泛应用于大
量植物种质资源的保存(Sakai等1990; Niino等2007;
Oh等2009; Hong等2009; Shatnawi等2011)。超低温
保存的关键因素是材料脱水, 玻璃化法通过将材
料进行高浓度玻璃化保护剂的处理, 最后一并投
入液氮中, 从而使材料进入玻璃化状态(王君晖和
黄纯农1994)。但高浓度的玻璃化保护剂如PVS2等
因具化学毒性或高渗透压而对植物造成一定程度
的伤害(Maruyama等1998; Sakai和Engelmann 2007);
相同程序在不同的植物, 甚至同属不同品种或者
基因型上常有较大的差异。如何通过技术的改良
及优化, 寻找一种常规的超低温保存程序, 尽可能
减少材料保存中的化学及物理伤害, 同时, 又具备
广适性, 是低温生物学中的研究热点。小滴玻璃
化法(droplet-vitrification)兼容了传统滴冻法(drop-
let-freezing)和玻璃化法(vitrification)的优点, 在解
决以上问题上显示出优越性。
2 小滴玻璃化法
2.1 小滴玻璃化法的概念
根据是否形成冰晶, 超低温保存分为两大类,
一类是常规超低温保存法, 另一类则是基于玻璃
化法的超低温保存法, 但两者均有一定的局限性
(Gonzalez-Arnao等2009)。最早的滴冻法是由
Kartha等(1982)首次提出, 并应用于木薯(Manihot
esculenta)的茎尖超低温保存, 其将茎尖置于玻璃
化液滴中, 再于程序化降温仪中逐步降温。小滴
玻璃化是在此基础上并结合传统玻璃化法的主要
程序, 即用装载液及玻璃化液对材料进行处理, 而
后将材料放在含有玻璃化液滴的铝箔纸上并投入
液氮冻存的一种高效超低温保存法。Leunufna和
Keller (2003)首次在植物材料山药属上采用小滴玻
璃化法。Halmagyi等(2010a, b)以苹果栽培品种茎
尖为试材, 采用小滴玻璃化法, 获得了60%~70%的
再生率。Kim等(2006)成功冻存了马铃薯的野生及
园艺品种, 再生率最高达到94.4%。目前小滴玻璃
化法已成功应用于17个科26个属约30个种的不同
植物上, 特别是在马铃薯、苹果、甘蔗、薯蓣及
菊属等植物上已广泛研究(表1)。
2.2 基本程序
小滴玻璃化法主要基于传统玻璃化法, 但因
其高效的冻存效果, 实际操作中常省略部分程序,
而使整个方法得到简化(Senula等2007; 白建明等
2010)。本文中以Sant等(2008)在芋头上使用小滴
玻璃化法超低温保存为例, 介绍其常用的标准程
序(图1)。
2.2.1 材料的获得 选继代2~3个月的外植体, 在无
菌条件下, 用双目解剖镜剥取0.8~1.0 mm茎尖, 包
含1~2个幼嫩叶原基的顶端分生组织及基部约1
mm3的原组织(图1, 步骤I)。
2.2.2 预培养 将剥离的茎尖放入含有0.3 mol·L-1蔗
糖的固体培养基中, 正常培养条件下进行1 d以上
的培养(图1, 步骤II)。
2.2.3 loading装载 预培养后的茎尖转移到McCa-
rtney瓶(也可用1.8或2 mL冷冻管)中, 瓶内装有5
mL已过滤灭菌的装载液(2 mol·L-1甘油+0.4 mol·L-1
蔗糖+MS, pH 5.8, Sakai等1990), 在25 ℃室温下处
理20 min后, 将茎尖转移至无菌滤纸上停留30 s, 吸
除多余的装载液(图1, 步骤III)。也有研究认为装
载这一步骤可去除, 不影响冻存效果(Kim等2006;
Halmagyi等2010a, b)。
2.2.4 脱水处理 将材料在0 ℃条件下放入装有玻
璃化液PVS2 (30%甘油+15%乙二醇+15% DMSO+
0.4 mol·L-1蔗糖+MS, pH 5.8, Sakai等1990)的McCa-
rtney瓶进行20~40 min脱水处理, 磁力搅拌器以60
rpm进行混匀(图1, 步骤IV)。利用无菌的一次性针
管吸取5~8滴玻璃化液(每滴4~15 µL)滴到已消毒
的铝箔条上(5 mm×20 mm), 将脱水后的茎尖转至
铝箔条上的玻璃化液滴里, 每滴约含5个茎尖。铝
箔条在使用前5 min左右置于冰盒中降温至0 ℃左
右(图1, 步骤V)。
2.2.5 液氮冻存 脱水处理后, 用镊子将附有茎尖
的铝箔条直接浸入液氮至液氮停止沸腾, 然后迅
速将其转入2 mL装满液氮的冷冻管中, 至少保存1
h以上(图1, 步骤VI)。
2.2.5 快速化冻 用镊子从液氮中取出冷冻管中的
铝箔条, 室温下迅速浸入已灭菌, 含1.2 mol·L-1蔗糖
的液体MS洗涤液(Sakai等1990)中, 在室温(25 ℃)
吴昀等: 超低温保存植物种质资源的新途径——小滴玻璃化法 513
下洗涤15 min (图1, 步骤VII)。或可将铝箔条先浸
入用40 ℃温水预热过的洗涤液约30 s后, 转入新鲜
的洗涤液中洗涤(Kim等2006a, b)。
2.2.6 恢复培养 将洗涤后的茎尖先转到含0.3 mol·L-1
蔗糖的固体MS培养基上, 培养基上方铺2层已消毒
的滤纸, 进行恢复培养, 室温(25 ℃)暗培养一夜。
而后将茎尖转接到含0.1 mol·L-1蔗糖的固体MS培
养基上, 于黑暗条件下培养5 d后转到弱光条件(3.5
μmol·m-2·s1)培养10 d左右。
2.3 主要优点
2.3.1 高存活率、再生率 小滴玻璃化法在传统玻
璃化法主要优点的基础上, 在冷冻及化冻程序上
进行了改良。一般将材料常规玻璃化后, 置于铝
箔纸上的小液滴内, 后直接投入盛满液氮的冷冻
管。一方面, 在冷冻过程中, 材料与玻璃化保护剂
及液氮直接接触, 降温速度加快, 均一晶核很少或
几乎未形成, 或者生长缺乏足够的时间, 溶液更易
进入无定形的玻璃化状态, 减少了溶液效应对细
胞的损伤, 亦无冰晶对细胞的损伤; 另一方面, 在
复温过程中, 材料与洗涤液直接接触, 因其受热均
匀, 同步融化, 从而避免了次生结冰对组织细胞的
损伤(王君晖和黄纯农1994)。铝箔纸在程序中成
为一种良好的热传导载体材料, 热量传导快速、
分布均一(Leunufna和Keller 2003)。因而小滴玻璃
表1 小滴玻璃化法成功保存植物种质资源列表
Table 1 Plant species and cultivars successfully cryopreserved by droplet-vitrification
植物种类 冻存材料 参考文献
樱桃李(Prunus cerasifera) 茎尖 Vujovic等2011
黑莓(Rubus fruticosus ‘Cacanska Bestrna’) 茎尖 Vujovic等2011
补血草(Limonium serotinum) 茎尖 Barraco等2011b
甘蔗(Saccharum spp. ‘CP52-43’) 茎尖, 胚性愈伤 Barraco等2011a; Martinez-
Montero等2008
苹果(Malus domestica ‘Pinova’, ‘Jonagold’, ‘Florina’, ‘Idared’, ‘Colmar’, 茎尖, 腋芽 Condello等2009, 2011;
‘Rebra’, ‘Romus4’, ‘M106’) Halmagyi等2010a, b
北美红杉(Sequoia sempervirens) 顶芽和基生芽 Ozudogru等2011
香石竹(Dianthus caryophyllus) 茎尖 Kentaro等2011; 张晓宁2011
切花百合(Lilium hybrida ‘Siberia’, ‘Snow Queen’) 顶端分生组织 Chen等2011
卷丹(Lilium lancifolium) 顶端分生组织 Chen等2011
红藤仔草(Rubia akane) 毛状根 Kim等2010
巨型兰花(Grammatophyllum speciosum) 原球茎 Sopalun等2010
百里香(Thymus moroderi) 茎尖 Marco-Medina等2010
红叶石楠(Photinia fraser ‘photinia×fraseri’ ) 茎尖, 分生组织 Tokatli和Akdemir 2010
香蕉(Musa spp., paradisiacal) 茎尖, 分生组织 李俊慧等2010; Panis等2005
甘薯(Ipomoea batatas) 茎尖 刘丽芳2009
香荚兰(Vanilla planifolia) 顶端分生组织 Gonzalez-Arnao等2009
大蒜(Allium sativum ‘Danyang’, ‘Mokpo’) 顶芽, 茎尖及花梗, 芽原基 Kim等2006, 2007, 2009a, 2009b
小菊(Dendranthema grandiflora ‘Peak’) 茎尖 Kim等2009a, b
木樨榄(Olea europaea) 体细胞胚 Sanchez-Romero等2009
草莓(Fragaria×ananassa ‘Senga Sengana’, ‘Korona’ , ‘Aroma’) 茎尖 Pinker等2009
银白杨(Populus alba) 茎尖 Tsvetkov等2009
白芨(Bletilla striata) 种子及原球茎 Jitsopakul等2008
天竺葵类(Pelargonium×hortorum) 顶芽 Gallard等2008
芋(Colocasia esculenta ‘Esculenta’) 茎尖 Sant等2008
薄荷属(Mentha spp.) 茎尖 Senula等2007
马铃薯(Solanum tuberosum ‘Dejima’ , ‘STN13’, ‘Desiree’, ‘Ostar’, ‘Sante’) 茎尖 Leunufna和Keller 2005;
Halmagyi等2005; Kim等2006;
Yoon等2006, 2007; 王彪2011
白建明等2010
杂种月季(Rosa hybrid) 茎尖 Halmagyi和Pinker 2006
山药属(Dioscorea spp. ) 芽及茎尖 Leunufna等2003, 2005
菊花(Chrysanthemum morifolium) 茎尖 Halmagyi等2004
植物生理学报514
化法最大的特征就是提高了冷冻和化冻的速率,
增加了形成均一玻璃化态的可能(Panis等2005)。
在已有的超低温方法中, 小滴玻璃化法冻后
存活率及再生率更高。白建明等(2010)以马铃薯
(Solanum tuberosum)茎尖为试材, 小滴玻璃化法保
存后存活率和再生率最高达79.91%和62.52%。
Martinez-Montero等(2008)将玻璃化法、包埋玻璃
化法及小滴玻璃化法同时应用于甘蔗体细胞胚超
低温保存, 测定细胞电导率以反映其脱水伤害, 试
验进一步证实了电解液渗透量与体胚活性呈显著
负相关。普通玻璃化处理甘蔗体胚成活率为0, 包
埋玻璃化法PVS2处理10~15 min仅获20%成活率,
而小滴玻璃化法将PVS2处理时间延长至30~45 min
时仍可获得高达30%的细胞存活率。Tsvetkov等
(2009)将不同的玻璃化法程序应用于木本模式植
物白杨属Populus alba及hybrid aspen (P. tremula×
P. tremuloides), 小滴玻璃化法存活率最高, 分别达
64%及78%。相同的研究结果在北美红杉(Ozu-
dogru等2011)、苹果属(Halmagyi等2010a, b)、巨
型兰花(Sopalun等2010)、木樨榄(Sanchez-Romer
等2009)、甘蔗(Martinez-Montero等2008)、薯蓣属
(Leunufna和Keller 2003)、百里香属(Marco-Medi-
na等2010)、甘薯(刘丽芳2009)等植物上均有体现,
且冻存材料遗产稳定性好, 不易形成愈伤组织。
Barraco等(2011)指出包埋脱水法比小滴玻璃化法
在保存甘蔗茎尖再生率时约高出26%, 这是仅有的
1篇本方法劣于其它方法的报道。笔者认为可能
与材料本身的基因型有关。
2.3.2 广适性 Schafer-Menuhr等(1997)报道了采用
快冻法建立马铃薯品种资源库, 马铃薯经DMSO处
理后, 转至2.5 mL附于铝箔纸的液滴上进行冻存,
此法可适用于150余种马铃薯品种, 流式细胞术及
DNA指纹分析技术分析显示161个被测样品无任
何染色体或异常条带出现, 这是最早关于超低温
广适性程序的探索。王彪(2011)以中国主栽马铃
薯品种‘紫花白’为试材, 成功建立起小滴玻璃化法
保存程序, 获得高达70%的再生率, 将此程序用于
13个中国主栽的马铃薯品种, 获得平均50%的再生
率。而在国外, 芋(Sant等2008)、银白杨(Tsvetkov
等2009)、马铃薯(Sant等2008)等植物也报道了广
图1 茎尖小滴玻璃化法主要程序示意图(改自Tsvetkov等2009)
Fig.1 Schematic diagram of droplet-vitrification procedure for shoot tips
吴昀等: 超低温保存植物种质资源的新途径——小滴玻璃化法 515
适性小滴玻璃化法程序, 即同一程序可广泛应用
于同属的多个品种或者基因型。
2.3.3 处理量大、操作简易 传统玻璃化法单管处
理材料较少, 常为10~15个外植体, 而小滴玻璃化
法增加了同一时间内处理材料的数量, 一般1条铝
箔纸可点5~8滴玻璃化液滴, 每滴可容纳5个外植
体, 故大大节约了时间及人力, 同时, 相比包埋法
等, 方法简单, 易于操作。
3 小滴玻璃化法的应用前景及存在问题
3.1 应用前景
3.1.1 广适性保存程序 Kim等(2006a, b)将同一小
滴玻璃化法程序应用于12种马铃薯品系, 其中包
括较难保存的野生种窄刀薯(Solanum stenotomum)
杂种系(STN13, 2X), 保存存活率达64.4%~94.4%,
该程序被韩国国家高原农业局(National Institute of
Highland Agriculture)应用于韩国马铃薯资源搜集
与离体保存工作。Kim等(2007a, b)还利用小滴玻
璃化法对252个品系的葱属植物未成熟花进行保
存, 获得80.9%的平均存活率和77.0%的平均再生
率, 其中221个品系进行了液氮的长期保存。刘丽
芳(2009)采用优化的小滴玻璃化法对国家种质徐
州甘薯试管苗库内的7个品种进行保存, 保存后存
活率最高达64%, 再生率最高46%。所以, 超低温
法相比种质圃及试管苗库产出高、投入低、安全
有效。小滴玻璃化法的广适性特征适用于重要种
质库的建立。
3.1.2 低温疗法 植物在长期营养繁殖过程中常受
到各种病毒病害的侵染, 降低作物的产量和质量,
影响观赏植物的观赏价值, 从而造成极大的经济
上的损失。常规的脱毒方法主要有热处理法、茎
尖分生组织培养法、愈伤组织培养法、茎尖微体
嫁接技术等(王永伟等2008)。而随着超低温保存
技术研究的深入, 人们逐步发现超低温保存具有
脱除植物病毒的作用(Heliot等2003; Wang等2003;
陈芳和王子成2006), 从而形成了低温疗法的概
念。低温疗法是基于超低温保存对细胞的选择性
破坏的原理, 结合组织培养和病毒检测技术达到
脱毒的目的。这主要是由于含有病毒的细胞和顶
端分生组织细胞含水量的差异造成的, 含水多的
病毒细胞更易于形成冰晶, 常受到冻害而死亡, 因
而处理过的植株再生后可能是无病毒的(Brison等
2002)。传统的脱毒方法常有操作困难、费时、脱
毒率低等局限性 , 而低温疗法则操作简单、快
速、脱毒率高, 是植物病毒脱除的一种新技术(陈
芳和王子成2006)。Kim等(2007a, b)发现, 经过小
滴玻璃化法保存后再生的瓶苗相比仅经过预处理
或脱水处理再生的瓶苗, 在RT-PCR检测后植株所
含的病毒密度更低。王彪(2011)在其研究中以感
染马铃薯Y病毒(PVY)的马铃薯‘紫花白’和感染了
马铃薯卷叶病毒(PLRV)的Desiree试管苗为试材,
开展超低温疗法脱除马铃薯病毒的研究, 研究结
果正在检测中。小滴玻璃化法保存的材料有望得
到无病毒或者较少感染的材料。但这项技术的发
展历史还较短, 成功的案例尚少, 更多的结合小滴
玻璃化法进行植物材料脱毒的研究还需进一步展
开。
3.1.3 珍稀及濒危植物的保存 除栽培种以外的野
生植物统称为野生植物种质资源。在这些野生植
物资源中, 往往具有栽培品种所没有的优异的遗
传多样性, 如抗性种质、耐性种质、独特的品种
种质、提高产量的种质和培育雄性不育所需要的
种质等, 因此, 野生种质资源对育种工作具有特殊
的意义(李仁全1994)。但随着环境的恶化、人为
的破坏, 这些资源正逐步减少种内和种间的多样
性, 保护植物的遗传多样性已刻不容缓(殷晓辉和
舒理慧1996)。尤其是需保存稀少野生种质和面临
绝种危险的植物, 更具有重要价值, 用于种质收集
保存与交换的种质库体系的建立将会大大改善野
生资源保存的现状。超低温保存作为种质资源保
存的安全、有效途径, 可用于珍稀及野生资源的保
存中。Mallon等(2008)采用玻璃化法保存濒危植物
矢车菊(Centaurea ultreiae), 成功实现了其茎尖的
冻存程序。Dixit等(2005)以一种珍贵的药用山药
植物三角叶薯(Dioscorea deltoidea)为试材, 采用玻
璃化法及包埋脱水法, 用HPLC对保存后的茎尖进
行检测, 得出内含的薯蓣皂苷配基含量与对照的
无差异。Thammasiri (2008)则在其综述中详细介
绍了几种珍稀的泰国产兰花的超低温冻存, 获得
了较为理想的保存效果。通常野生种相对于栽培
种常常显示较低的恢复生长水平, 可能是因为野
生种本身在离体和正常栽培条件下生活力均较低
(Yoon等2007)。故选用更佳的超低温保存程序, 尽
可能多的保存野生珍稀和濒危植物材料, 成为一
个重要的发展方向。小滴玻璃化法由于其较好的
植物生理学报516
保存效果, 正逐步应用到这些材料上。
3.2 存在问题
本校课题组将小滴玻璃化法应用于百合属植
物资源保存, 试验中遇到的主要问题为细菌侵染,
材料直接接触液氮易造成外植体污染, 如何保证
优质干净的液氮作为保存载体, 成为重点关注的
对象。白建明等(2010)采用SSR标记, 王彪(2011)
采用ISSR标记等技术对小滴玻璃化法保存材料遗
传稳定性进行检测, 发现再生植株无遗传变异。
但相关工作仍较少(Schafer-Menuhr等1997; 李俊慧
等2010), 需在今后的工作中进一步展开, 以便深入
了解其内在机理。
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