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Study on cryopreservation and genetic stability of embryogenic calli induced from Dioscorea bulbifera microtuber

黄独微型块茎胚性愈伤组织超低温保存及遗传稳定性研究



全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 17 期 2015 年 9 月

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黄独微型块茎胚性愈伤组织超低温保存及遗传稳定性研究
尹明华,洪森荣*
上饶师范学院生命科学学院,江西 上饶 334001
摘 要:目的 对影响黄独 Dioscorea bulbifera 微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存的多种因素进行探讨,并从形态学、
生理学、DNA 量以及光合特性参数和叶绿素荧光参数等方面对其冻后再生苗的遗传稳定性进行检测。方法 采用微型块茎及其胚
性愈伤组织进行诱导,小滴玻璃化法超低温保存,通过检测包括总叶绿素量、可溶性蛋白量、可溶性总糖量以及超氧化物歧化酶
和过氧化物酶活性等植物生理指标,并采用流式细胞术的方法对遗传稳定性进行考察。结果 最佳的黄独微型块茎胚性愈伤组织
超低温保存条件:室温下将黄独微型块茎胚性愈伤组织块转入 MS+2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 2,4-D+0.3 mol/L 蔗糖的
培养基中预培养 1 d。预培养后的胚性愈伤组织块在(25±1)℃下转入装载液(MS+2 mol/L 甘油+0.4 mol/L 蔗糖,pH 5.8)中
处理 20 min,再用 100% PVS2 于 0 ℃脱水 40 min。脱水后将材料转入铝箔条上的 PVS2 小滴中,液氮冰冻后迅速将材料转入冷
冻管中(装满液氮)。投入液氮罐保持 1 d 后,取出铝箔条,浸入 37 ℃洗涤液(MS+2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 2,4-D+
1.2 mol/L 蔗糖,pH 5.8)中,胚性愈伤组织块脱落后,室温下再用新鲜洗涤液对其洗涤 3 次,每次 10 min。洗涤后的材料接入分化
培养基(MS+2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+5 g/L 琼脂粉)中,暗培养 2 d 后转到 12 h/d 的光周期中培养,细胞存活率
达 89%以上。黄独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存后的再生苗与胚性愈伤组织常温再生苗在形态指标和生理指标等
方面均无显著性差异(P>0.05),两者的DNA 量也未发生显著变化(P>0.05)。结论 建立了黄独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃
化法超低温保存的技术体系,其再生植株经检测无遗传变异,为薯蓣属植物种质资源的长期保存提供了理论依据和技术基础。
关键词:黄独;微型块茎;胚性愈伤组织;小滴玻璃化法;超低温保存
中图分类号:Q942;R282 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2015)18 - 2623 - 09
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.18.020
Study on cryopreservation and genetic stability of embryogenic calli induced from
Dioscorea bulbifera microtuber
YIN Ming-hua, HONG Sen-rong
College of Life Sciences, Shangrao Normal University, Shangrao 334001, China
Abstract: Objective To discuss the influence of several factors on the cryopreservation of embryogenic calli induced from
Dioscorea bulbifera microtuber by droplet-vitrification and to test the genetic stability of the regenerated plantlets after freezing from
the aspects of morphology, physiology, DNA content, as well as the photosynthetic characteristics and chlorophyll fluorescence
parameters in this paper. Methods Plant tissue culture (including microtuber induction and embryogenic callus induction), plant
physiology index detection (including total chlorophyll, soluble protein, soluble sugar and superoxide dismutase enzyme and peroxide
enzyme activity), and cell flow cytometry were applied. Results The best cryopreservation conditions of embryogenic callus of D.
bulbifera microtuber were as following: Embryogenic calli were precultured in liquid media of MS + KT 2 mg/L + NAA 0.5 mg/L +
2,4-D 0.5 mg/L + 0.3 mol/L sucrose for 1 d and then treated in loading liquid (MS + 2 mol/L glycerol + 0.4 mol/L sucrose, pH 5.8) for
20 min. In order to dehydrate, embryogenic calli were transferred in 100% PVS2 at 0 ℃ for 40 min. After dehydration, the
embryogenic calli were inoculated to PVS2 small drops in the aluminum foil strips and then dipped in liquid nitrogen (LN). Finally the
aluminum foil strips were quickly transferred to freezing tube that filled with LN and then put into LN tank. After conserving for 1 d in
LN, the aluminum foil strips were removed and the embryogenic calli were immersed into liquid washing media (MS + KT 2 mg/L +
NAA 0.5 mg/L + 2,4-D 0.5 mg/L + 1.2 mol/L sucrose, pH 5.8) preheated in 37 ℃ warm water. After separated from the aluminum foil
strips, the embryogenic calli were washed with fresh liquid washing media at room temperature for there times, 10 min each time. After
washing, the embryogenic calli were transferred onto differentiation medium (MS + KT 2 mg/L + NAA 0.5 mg/L + 30 g/L sucrose + 5

收稿日期:2015-02-01
基金项目:国家自然科学基金项目(31360072);江西省教育厅 2014 年度科学技术研究一般项目(GJJ14713)
作者简介:尹明华,硕士,副教授,研究方向为生物技术。E-mail: yinminghua04@163.com
*通信作者 洪森荣(1974—),男,硕士,副教授,研究方向为植物生物技术。E-mail: hongsenrong@163.com
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g/L agar), and cultured in dark for 2 d and then cultured in 12 h/d photoperiod, the cell survival rate reaches above 89%. The
morphological and physiological indexes and the content of DNA of two kinds of plantlets, which regenerated from cryopreserved and
non-cryopreserved embryogenic calli induced from D. bulbifera microtuber by droplet-vitrification, showed no significant difference (P >
0.05). Conclusion Cryopreservation technology system of embryogenic calli induced from D. bulbifera microtuber by droplet-vitrification
is established and the regeneration plants have no genetic variation, which provides the theoretical basis and technical basis for the long-term
preservation of germplasm resources in the plants of Dioscorea L.
Key words: Dioscorea bulbifera L.; microtuber; embryogenic callus; droplet-vitrification; cryopreservation

黄独 Dioscorea bulbifera L. 隶属于薯蓣科
(Dioscoreaceae)薯蓣属 Dioscorea L.[1],其地下块
茎可入药,主治甲状腺肿大、咽喉肿痛、咯血、百
日咳等病,也可抑制肿瘤生长。因此,保存黄独的
种质资源具有重要意义。
目前,保存植物种质资源的方法主要有田间保
存和离体保存的方法。田间保存需要大量的人力、
物力和财力,而且容易受到自然灾害的侵袭。而离
体保存是利用植物组织培养的方法对植物材料进行
保存,可分为一般保存、超低温保存和缓慢生长法
离体保存[2]。一般保存和缓慢生长法离体保存需经
常继代,容易污染和发生体细胞变异,且变异的可
能性将随着保存时间的增加而增大[3]。超低温保存
是一种安全、有效的种质资源保存途径,可长期保
存种质资源[4]。小滴玻璃化法超低温保存是在滴冻
法和玻璃化法基础上发展起来的用于植物种质资源
保存的新技术,其主要优点是高存活率、高再生率
以及广适性,而且处理量大、操作简易[5]。目前,
利用小滴玻璃化法已成功保存了蔷薇茎尖[6]、芋头
茎尖[7]、香草茎尖[8]、阿月浑子树茎尖[9]、樱桃砧木
茎尖[10]、桃棕体细胞胚[11]、鳄梨胚性培养物[12]、枣
椰树分生组织[13]、葡萄茎尖[14]、巢蕨原叶体和绿色
球状体[15]、Byrsonima intermedia A. Juss. 茎尖[16]、
百合茎尖[17]、油棕多胚体[18]、月季芽[19]、茜草毛状
根[20]、香蕉分生组织[21]、菊花茎尖[22]、犬蔷薇和锈
红蔷薇茎尖[23]、弥勒苣苔茎尖[24]等多种植物材料。
而关于黄独的研究多集中于组织培养[25]、遗传多样
性[26]、珠芽形成[27]、药理学[28]、基因表达[29]以及药
用成分分析[30]等方面,黄独微型块茎胚性愈伤组织
小滴玻璃化法超低温保存的研究尚未见报道。本实
验将对黄独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法超
低温保存进行研究,旨在为其种质资源的长期保存
提供理论依据和技术基础。
1 材料和方法
1.1 材料
样品由上饶师范学院生命科学学院植物组织培
养室提供,经上饶师范学院生命科学学院洪森荣副
教授鉴定为黄独 Dioscorea bulbifera L. 试管苗诱导
的微型块茎。
1.2 方法
1.2.1 胚性愈伤组织诱导 将黄独试管苗诱导的成
熟微型块茎切成片状(1~2 mm 厚),分别接种到
诱导培养基上。诱导培养基为 MS+TDZ 2 mg/L+
6-BA 1 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+30 g/L 蔗糖+5 g/L
琼脂粉,pH 5.8~6.0。接种完后置于黑暗条件下培
养,温度为(25±1)℃。60 d 后,取其胚性愈伤组
织于上述诱导培养基上继代 2 次,每次 30 d,然后
将其应用于黄独小滴玻璃化法超低温保存实验。
1.2.2 小滴玻璃化法超低温保存 在(25±1)℃下,
约 0.2 g 黄独微型块茎胚性愈伤组织转入预培养基
中进行预培养。预培养分 2 种方式进行处理:(1)
将胚性愈伤组织转入 MS+2 mg/L KT+0.5 mg/L
NAA+0.5 mg/L 2,4-D+0~0.4 mg/L 蔗糖的液体培
养基中,预培养 5 d;(2)将胚性愈伤组织块转入
MS+2 mg/L KT+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 2,4-D+
0.3 mg/L 蔗糖的液体培养基中,预培养 0~10 d。考
察预培养液蔗糖浓度和预培养时间,以上 2 种预培
养方式的条件均为:光照时间 12 h/d;光照强度
1 000~2 000 lx;温度(25±1)℃。
预培养后,将胚性愈伤组织在(25±1)℃下转
入装载液(MS+2 mol/L 甘油+0.4 mol/L 蔗糖,pH
5.8)中处理 0~50 min。考察装载时间,取出材料后,
用无菌滤纸吸去胚性愈伤组织块表面附着的装载液。
装载后,胚性愈伤组织用 100% PVS2 [300 g/L 甘
油+150 g/L 乙二醇+150 g/L 二甲基亚砜(DMSO)+
0.4 mol/L 蔗糖,pH 5.8] 于 0 ℃脱水 0~50 min。
脱水完成后,用移液枪吸取 5 滴 PVS2(每滴
15 μL)滴到铝箔条上(0.8 cm×4 cm,0.03 mm),
然后将脱水后的胚性愈伤组织转入到铝箔条上的
PVS2 小液滴中。材料浸入液氮中冰冻后迅速将其
转入 2 mL 装满液氮的冷冻管中,然后投入液氮保
持 24 h。取出冷冻管中的铝箔条,分别浸入用 4、
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25、37、45 ℃恒温预热过的洗涤液(MS+KT 2
mg/L+NAA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+0~1.6
mol/L 蔗糖的液体培养基,pH 5.8)中。考察化冻
温度和洗涤液中蔗糖浓度,胚性愈伤组织脱落后
再用新鲜洗涤液在(25±1)℃下洗涤 3 次,每次
10 min。
洗涤后,将胚性愈伤组织转入分化培养基(MS+
KT 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L 蔗糖+5 g/L 琼
脂粉)上,然后置于 2 种培养条件下进行恢复培养。
(1)将洗涤后的胚性愈伤组织块直接置于光周期中
培养,光照 12 h/d;光照强度 1 000~2 000 lx;温
度(25±1)℃;(2)先将洗涤后的胚性愈伤组织块
暗培养 2 d,温度(5±1)℃,再转到光周期中
培养,光照 12 h/d;光照强度 1 000~2 000 lx;
温度(25±1)℃。
1.2.3 超低温保存细胞存活率检测 解冻后的胚性
愈伤组织用氯化三苯基四氮唑还原法(TTC)法测
定其生活力。按 Towill 等方法[31],称取 100 mg 洗
涤后的愈伤组织,加入 0.4% TTC 试剂和 0.1 mol/L
磷酸缓冲液(pH 7)各 2.5 mL,在黑暗下于 27 ℃
放置 24 h 后倒掉 TTC 液,用蒸馏水洗涤 3 次。再
加入 95%乙醇 5 mL,于 60 ℃水浴 30 min,用 731
型紫外光分光光度计在 485 nm 处测其吸光度(A)
值。用 A 值表示胚性愈伤组织在超低温保存后的细
胞活力。细胞存活率=超低温保存后细胞的 A 值/
超低温保存前细胞的 A 值。
1.2.4 再生苗的遗传稳定性检测 将超低温保存
的胚性愈伤组织块以及未进行超低温保存处理的
胚性愈伤组织块(CK)同时接入分化培养基(MS+
KT 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30 g/L 蔗糖+5 g/L
琼脂粉)上,40 d 后将分化的胚状体再次转入分
化培养基(MS+KT 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+30
g/L 蔗糖+5 g/L 琼脂粉),60 d 形成完整植株后对
以上 2 种再生苗进行形态学、生理学、流式细胞
术检测以及光合特性参数和叶绿素荧光参数的测
定。形态学检测包括株高、新生叶数、新生芽数、
新生根长等。
(1)生理学检测包括总叶绿素量、可溶性蛋白
量、可溶性总糖量以及超氧化物歧化酶(SOD)和
过氧化物酶(POD)活性。总叶绿素量的测定采用
丙酮比色法[31],可溶性蛋白量的测定采用考马斯亮
蓝 G-250 染色法[31],可溶性总糖量的测定采用蒽酮
比色法[31],POD 活性的测定采用愈创木酚法[32],
SOD 活性的测定采用 NBT 光还原法[32]。
(2)流式细胞术检测:全部操作均在冰浴中进
行,所用溶液均预冷。将黄独再生苗叶片置于溶液
A(0.25 mol/L 蔗糖,10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,3
mmol/L MgCl2,0.1 mmol/L 苯甲基磺酰氟化物)中
剪碎,研磨。用 400 目滤筛将匀浆液滤过,以 2 000×
g 离心(美国贝克曼高速冷冻离心机)10 min。沉淀
物悬浮于溶液 B,含 0.1% Triton×100 的溶液 A 中,
以 2 000×g 离心 10 min。弃上清,沉淀物悬浮于溶液
C(2.2 mol/L 蔗糖,10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,3
mmol/L MgCl2,0.1 mmol/L PMSF)中,取超速离心
管,每管加 2 mL 溶液 C,然后把细胞核悬液铺在溶
液 C 上层,以 25 000 r/min 离心 60 min。弃上清,
用溶液 A 轻轻荡洗管壁及沉淀物表面 2 次,将离心
管倒置,用滤纸擦干管口。向离心管底部滴加几滴
溶液 A,用玻璃棒轻轻搅匀,然后补加 1 mL 溶液 A。
再以 2 000×g 离心 20 min,弃上清,沉淀物为纯化
的细胞核。加 0.2 mL PI 溶液在暗处染色 10 min,然后
置流式细胞仪(BD FACSCalibur,美国BD 公司)测试。
(3)光合特性参数的测定:用 Li-6400 便携式
光合仪于 9︰00~11︰00 测定完全展开的第 3 片叶
的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、细胞间 CO2
浓度(Ci)、蒸腾速率(Tr)等参数,以及环境 CO2
浓度(仪器进气口的 CO2 浓度),并计算气孔限制
值(Ls)、水分利用效率(WUE)和瞬时羧化速率
(CUE),其公式分别为 Ls=1-Ci/Ca,WUE=Pn/Tr,
CUE=Pn/Ci,CUE 用于估测 RuBPCase(1,5-二磷酸
核酮糖羧化酶)的活性。使用开放式气路,光量子
通量密度(PPFD)设定为 1 000 μmol/(m·s),CO2
浓度(Ca)为 400 μmol/mol。
叶绿素荧光参数的测定:在同一叶片上用上述
Li-6400 便携式光合仪的荧光叶室测定荧光参数。叶
片充分暗适应 20 min 后设置原初的荧光参数,关闭
光化学光和远红光,打开测量光测定初始荧光(Fo),
再用饱和的脉冲闪光 [8 000 μmol/(m·s)] 测定最大
荧光(Fm),然后打开光化学活性光 [PPFD=450
μmol/(m·s)] 照射叶片,当稳态荧光(Fs)出现后,
再打开一个饱和脉冲闪光 [6 000 μmol/(m·s)] 测定
光适应后的最大荧光(Fm′),最后,关闭光化学活
性光,再施加远红光以测量光适应的最小荧光
(Fo′)。PSII 最大光化学效率 [Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm],
PSII 潜在光化学效率 [Fv/Fo=(Fm-Fo)/Fo],PSII
实际光化学效率 [ΦPSII=(Fm′-Fs)/Fm′],开放的
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PSII 反应中心捕获激发能效率 [Fv′/Fm′=(Fm′-
Fo′)/Fm′] 计算,光化学荧光猝灭系数 [qP=(Fm′-
Fs)/(Fm′-Fo′)],非光化学猝灭系数 [NPQ=1-
(Fv′/Fv)=1-(Fm′-Fo′)/(Fm-Fo)] 根据文献测定[33]。
1.2.5 统计方法 以上实验均重复 3 次,本实验所
有数据表示为 sx 。以上实验数据均用 SPSS 19.0
软件进行 One-Way ANOVA 分析,再进行 LSD 法
检验。
2 结果与分析
2.1 预培养时间和预培养液蔗糖浓度对超低温保
存的影响
表 1 表明,预培养时间过短或过长,均不利于
黄独微型块茎胚性愈伤组织超低温保存后的成活。
而 1 d 的预培养可以显著提高细胞存活率。表 1 也
表明,预培养液中蔗糖的浓度不能过低或过高,否
则将会显著降低细胞存活率。因此,黄独微型块茎
胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存较佳的预
培养条件为 MS+KT 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L+
2,4-D 0.5 mg/L+0.3 mol/L 蔗糖的液体培养基中预
培养 1 d。
2.2 装载时间对超低温保存的影响
表 2 表明,装载时间过短或过长,均不利于黄
独微型块茎胚性愈伤组织超低温保存后的成活。而
20 min 的装载可以显著提高细胞存活率。因此,黄
独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存
较佳的装载条件为MS+2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗
糖装载 20 min。
表 1 蔗糖浓度和预培养时间对黄独微型块茎胚性愈伤组织
小滴玻璃化法超低温保存的影响
Table 1 Effect of suerose concentration and preculture time
on cryopreservation of D. bulbifera microtuber embryogenic
callus by droplet-vitrification
蔗糖浓度/
(mg·L−1)
细胞存
活率/%
预培养
时间/d
细胞存
活率/%
0 35.6± 5.6 eE 0 42.5±11.4 eE
0.056 64.3± 8.4 dD 1 94.6± 3.1 aA
0.100 80.5± 9.7 bBC 2 80.2±14.5 bB
0.200 85.2±10.1 bB 5 83.4± 8.6 bB
0.300 92.8± 2.5 aA 7 70.5±12.6 cC
0.400 75.9±12.4 cC 10 59.8± 9.5 dD
同一列中大、小写字母分别表示在 0.01 和0.05 水平上的差异性,下同
The capital and small letters in the same volume stand for the
signification on 0.01 and 0.05 level, the same as below
表 2 装载时间对黄独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法
超低温保存的影响
Table 2 Effect of loading time on cryopreservation of D.
bulbifera microtuber embryogenic callus by droplet-vitrification
装载时间/min 细胞存活率/%
0 42.6± 8.5 eE
10 72.4± 6.4 cC
20 89.6± 4.3 aA
30 80.2±12.3 bB
40 69.5± 9.7 cC
50 60.4±10.4 dD
2.3 脱水时间对超低温保存的影响
表 3 表明,脱水时间过短或过长,均不利于黄独
微型块茎胚性愈伤组织超低温保存后的成活。而 40
min 的脱水可以显著提高细胞存活率。因此,黄独微
型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存较佳
的脱水条件为 100% PVS2(300 g/L 甘油+150 g/L 乙
二醇+150 g/L DMSO+0.4 mol/L 蔗糖)脱水 40 min。
2.4 化冻温度对超低温保存的影响
表 4 表明,化冻温度过低或过高,均不利于黄
独微型块茎胚性愈伤组织超低温保存后的成活。而
37 ℃的化冻温度可以显著提高细胞存活率。因此,
黄独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保
存较佳的化冻温度为 37 ℃。
表 3 脱水时间对黄独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法
超低温保存的影响
Table 3 Effect of dehydration on cryopreservation of D.
bulbifera microtuber embryogenic callus by droplet-
vitrification
脱水时间/min 细胞存活率/%
0 28.9±15.6 eE
10 46.4±14.3 dD
20 61.6± 9.5 cC
30 81.5± 5.8 bB
40 92.8± 3.2 aA
50 80.5± 9.6 bB

表 4 化冻温度对黄独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法
超低温保存的影响
Table 4 Effect of thawing on cryopreservation of D. bulbifera
microtuber embryogenic callus by droplet-vitrification
化冻温度/℃ 细胞存活率/%
4 50.8± 8.6 cC
25 65.4±13.6 bB
37 88.9± 8.9 aA
45 62.7± 5.4 bB
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2.5 洗涤液中蔗糖浓度对超低温保存的影响
表 5 表明,洗涤液中比较适合的蔗糖浓度为
1.2 mol/L,而洗涤液中蔗糖浓度过低或过高,均
不利于黄独微型块茎胚性愈伤组织超低温保存
后的成活。因此,黄独微型块茎胚性愈伤组织小
滴玻璃化法超低温保存较佳的洗涤中液蔗糖浓
度为 1.2 mol/L。
表 5 洗涤液中蔗糖浓度对黄独微型块茎胚性愈伤组织小滴
玻璃化法超低温保存的影响
Table 5 Effect of suerose concentration in washing solution
on cryopreservation of D. bulbifera microtuber embryogenic
callus by droplet-vitrification
洗涤液中蔗糖浓度/(mol·L−1) 细胞存活率/%
0 65.7±14.2 dC
0.4 72.6±10.5 cC
0.8 83.5± 8.4 bB
1.2 90.8± 5.2 aA
1.6 81.6± 8.9 bB

2.6 冻后培养条件对超低温保存的影响
表 6 表明,冻后直接转入光周期(12 h 光/暗)
中培养不利于黄独微型块茎胚性愈伤组织超低温保
存后的成活。而冻后先暗培养 2 d 再转到光周期(12
h 光/暗)中培养可以显著提高细胞存活率。因此,
黄独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保
存较佳的冻后培养条件为暗培养 2 d 后转入光周期
中培养(12 h 光/暗)。
表 6 冻后培养条件对黄独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃
化法超低温保存的影响
Table 6 Effect of culture condition after freezing on
cryopreservation of D. bulbifera microtuber embryogenic
callus by droplet-vitrification
冻后培养条件 细胞存活率/%
直接光周期中培养(12 h 光/暗) 82.7±5.4 bB
暗培养 2 d 后转入光周期中培养(12 h 光/暗)93.9±1.9 aA

2.7 冻后黄独微型块茎胚性愈伤组织再生苗的形
态学、生理学和细胞学检测
通过对黄独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法
超低温保存后的再生苗(图 1)与常温继代苗的形态指
标(株高、新生叶数、新生芽数、新生根长)、生理指
标(叶绿素量、可溶性蛋白量、可溶性总糖量以及 SOD
和 POD 活性)以及光合特性参数和叶绿素荧光参数相
比较,表 7 表明,这些指标和参数均无显著性差异
(P>0.05)。而且对黄独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻
璃化法超低温保存后的再生苗与常温继代苗的流式细
胞术检测也表明,两者的 DNA 量也未发生显著变
化(P>0.05,图 2)。因此,黄独微型块茎胚性愈伤组
织小滴玻璃化法超低温保存的实施可以从形态、生理、
光合和DNA 量上保证材料的遗传稳定性。
3 讨论
小滴玻璃化法超低温保存是目前应用较广泛的
一种植物种质资源超低温保存方法[5],其操作步骤
主要有预培养、装载、脱水、液氮冻存、化冻、洗
涤、恢复培养等[34]。


A-黄独微型块茎胚性愈伤组织诱导 B~D-超低温保存后黄独微型块茎胚性愈伤组织萌发出小芽 E~F-超低温保存后黄独微型块茎胚性愈伤组织再生苗
A-embryogenic calli induction of D. bulbifera microtuber B—D-shoots germinated from D. bulbifera embryogenic calli after cryopreservation
E—F- plantlets regenerated from D. bulbifera embryogenic calli after cryopreservation
图 1 黄独微型块茎胚性愈伤组织诱导及其超低温保存后的试管苗再生
Fig. 1 Embryogenic callus induction of D. bulbifera microtuber and its plantlets regeneration after cryopreservation
A B C
D E F
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表 7 常温胚性愈伤组织再生苗与冻后胚性愈伤组织再生苗形态指标、生理指标以及光合特性和叶绿素荧光参数的比较
Table 7 Comparison on morphological indexes, physiological indexes, cytological indexes, photosynthetic characteristics, and
chlorophyll fluorescence characteristics between regeneration plantlets in D. bulbifera microtuber embryogenic calli after
cryopreservation and without cryopreservation
指标和参数 常温胚性愈伤组织再生苗 冻后胚性愈伤组织再生苗
平均株高/cm 8.2±0.4 aA 7.9±0.6 aA
平均新生芽数/个 5.4±1.2 aA 5.1±0.9 aA
平均新生根数/条 5.9±1.3 aA 6.2±1.1 aA
平均新生叶数/片 6.2±2.1 aA 6.8±1.9 aA
总叶绿素量/(μg·g−1) 1.963±0.284 aA 1.872±0.329 aA
可溶性蛋白量/(mg·g−1) 0.753±0.241 aA 0.821±0.216 aA
可溶性总糖量/(mg·g−1) 0.946±0.231 aA 0.885±0.194 aA
POD 活性/(U·g−1) 0.694±0.214 aA 0.728±0.165 aA
SOD 活性/(U·g−1) 186.4±52.8 aA 191.6±42.7 aA
Pn/(μmol·m−1·s−1) 6.59±0.43 aA 6.18±0.28 aA
Gs/(μmol·m−1·s−1) 0.39±0.04 aA 0.35±0.04 aA
Ci/(μmol·mol−1) 214.82±21.34 aA 221.7±32.86 aA
Tr/(mmol·m−1·s−1) 2.55±0.62 aA 2.41±0.49 aA
Ls 0.463±0.042 aA 0.446±0.058 aA
WUE/(μmol·mmol−1) 2.584±0.216 aA 2.564±0.154 aA
CUE/(mmol·m−1·s−1) 30.68±0.42 aA 27.88±0.16 aA
Fo 69.42±4.29 aA 65.22±9.60 aA
Fm 412.62±35.21 aA 406.88±25.64 aA
Fv/Fm 0.832±0.014 aA 0.840±0.029 aA
Fv/Fo 4.944±0.068 aA 5.239±0.024 aA
ΦPSII 0.528±0.062 aA 0.534±0.019 aA
Fv′/Fm′ 0.498±0.065 aA 0.514±0.048 aA
qP 0.896±0.052 aA 0.851±0.022 aA
NPQ 0.784±0.056 aA 0.802±0.034 aA
同一行中大、小写字母分别表示在 0.01 和 0.05 水平上的差异性
Capital and small letters in same line stand for signification on 0.01 and 0.05 levels, same as below

图 2 常温胚性愈伤组织再生苗 (A) 与冻后胚性愈伤组织再生苗 (B) 的流式细胞术检测
Fig. 2 Cell flow cytometry detection between regeneration plantlets of D. bulbifera microtuber embryogenic calli after
cryopreservation and without cryopreservation
4 096
3 072
2 048
1 024
0




4 096
3 072
2 048
1 024
0




0 1 024 2 048 3 072 4 096 0 1 024 2 048 3 072 4 096
荧光强度
A B
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• 2629 •
预培养主要是通过高浓度的蔗糖来降低细胞内
自由水的量,以便有效降低冰点[35]。其预培养方式
一般有两步和一步之分。樱桃砧木茎尖采用两步预
培养(即 0.3 mol/L 蔗糖预培养 15 h 和 0.7 mol/L 蔗
糖预培养 5 h)效果较好[10],但大多数超低温保存
采用的是一步法预培养。百合茎尖[17]、菊花茎尖[22]、
香草茎尖[8]、弥勒苣苔茎尖[24]、Byrsonima intermedia
A. Juss. 茎尖[16]、油棕多胚体[18]预培养时,蔗糖浓
度一般为 0.3~0.6 mol/L,预培养时间一般为 12~
24 h。这与本实验结果一致。
装载对于以玻璃化为基础的超低温保存也十分
重要,而且找出适宜的装载时间对于超低温保存来
说一般具有实际意义[3]。目前装载液的成分一般为
0.4 mol/L 蔗糖+2 mol/L 甘油。但其装载时间因植
物种类而异。在百合茎尖[17]、犬蔷薇和锈红蔷薇茎
尖[23]、香草茎尖[8]、巢蕨原叶体和绿色球状体[15]、
月季芽[19]装载时,装载时间一般为 20~40 min。在
某些植物种类中,装载液的成分需要发生一些改变,
如油棕多胚体[18]和樱桃砧木茎尖[10]适宜的装载液
分别为 10% DMSO+0.7 mol/L 蔗糖以及 0.5 mol/L
蔗糖+1.9 mol/L 甘油,但其装载时间一般维持在 30
min。现在也有些学者认为装载这一步骤可免去,
不会影响冻存效果[5-6]。
装载后还需要对超低温保存的材料进行脱水。
脱水一般在 0 ℃采用 PVS2 处理[34]。但 PVS2 具体
的脱水时间也与植物材料种类相关。月季芽[19]、油
棕多胚体[18]、巢蕨原叶体和绿色球状体[15]、菊花茎
尖[22]、犬蔷薇和锈红蔷薇茎尖[23]、蔷薇茎尖[6]、芋
头茎尖[7]的 PVS2 处理时间一般为 10~40 min,这
与本实验结果相类似。但有些植物 PVS2 处理需要
更长的时间。如鳄梨胚性培养物[12]、弥勒苣苔茎
尖[24]和百合茎尖[17]的 PVS2 处理时间分别为 600
min、90 min 和 4 h。而且在某些植物的小滴玻璃化
法超低温保存实验中,也有用 PVS3(50%甘油+
50%蔗糖)进行脱水处理的。如香草茎尖[8]和桃棕
体细胞胚[11]经过 PVS3 室温下 30 和 120 min 后,材
料的细胞成活率得到了显著提高。
在小滴玻璃化法超低温保存中,液氮保存时间
一般不会影响植物材料的保存效果,预试验结果也
表明,在液氮中超低温保存 24 h、48 h、15 d 和 30 d,
其超低温保存效果无显著性差异。因此,本实验一
般选择 24 h 的液氮保存时间。但超低温保存后的化
冻方式对植物细胞的冻后存活率具有显著的影响。
芋头茎尖的化冻温度为 25 ℃[7]。但樱桃砧木茎尖
的化冻温度为 37 ℃[10]。这与本实验结果一致。
化冻后对材料进行洗涤也是一个常规步骤。洗
涤效果主要取决于洗涤液中的蔗糖浓度。在百合茎
尖[17]、油棕多胚体[18]以及犬蔷薇和锈红蔷薇茎尖[23]
的洗涤液蔗糖浓度均为 1.2 mol/L。这些研究与本实
验结果一致。但有些植物材料超低温保存后需要较
低浓度的蔗糖浓度洗涤,如樱桃砧木茎尖的洗涤液
蔗糖浓度为 0.8 mol/L [10]。
目前也有很多报道表明,在小滴玻璃化法超
低温保存后进行适宜时间的黑暗培养后再转入光
周期中培养,细胞存活率和再生率一般会显著提
高[22]。本实验结果也表明,黄独微型块茎胚性愈伤
组织小滴玻璃化法超低温保存较佳的冻后培养条件
为暗培养 2 d 后转入光周期中培养(12 h 光/暗)。
但油棕多胚体小滴玻璃化法超低温保存研究的结果
表明,冻后材料直接转入 16 h 的光周期中,也可获
得 68%的再生率[18]。
细胞的冻后存活表明了小滴玻璃化法超低温保
存的可行。但种质资源超低温保存还需要对其再生
苗的遗传稳定性进行检测。菊花茎尖小滴玻璃化法
超低温保存后的再生苗经流式细胞术检测,发现其
与正常继代苗无显著性差异[22]。本实验也表明,黄
独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存
后的再生苗与常温继代苗在 DNA 量、形态指标、
生理指标以及光合特性和叶绿素荧光参数等方面均
无显著性差异。这些结果表明,小滴玻璃化法超低
温保存可以用来长期保存黄独微型块茎的胚性愈伤
组织。但仅有这些结果还不够,今后还将对黄独微
型块茎胚性愈伤组织小滴玻璃化法超低温保存后的
再生苗进行分子标记方面的检测,从分子方面来论
证本实验建立的黄独微型块茎胚性愈伤组织小滴玻
璃化法超低温保存程序的可行性。
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