全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月 981
小酸浆(Physalis minima L.)茎尖的玻璃化法超低温保存
曲先, 王子成 *, 梁晨
河南大学生命科学学院农业生物技术研究所, 河南开封 475004
Cryopreservation of Physalis minima L. Shoot-tips by Vitrification
QU Xian, WANG Zi-Cheng*, LIANG Chen
Institute of Agricultural Biotechnology, College of Life Science, Henan University, Kaifeng, Henan 475004, China
提要: 用玻璃化法超低温保存小酸浆茎尖的结果表明, 1 cm的小酸浆茎段放在改良MS培养基上室温预培养 3 d后, 切取2
mm长的茎尖放在0 ℃条件下用100% PVS2溶液中处理70 min, 快速投入液氮保存, 1 d后取出, 于40 ℃恒温水浴中化冻2~3
min后用含 1.2 mol·L-1蔗糖的改良MS培养液洗涤 30 min, 接种于再生培养基上暗培养 7 d再转接至正常光照 35 µmol·m-2·s-1
条件下, 成活率可达36.0%, 再生植株生长正常。
关键词: 小酸浆; 超低温保存; 玻璃化法
收稿 2008-07-17 修定 2008-09-10
资助 河南大学校内基金(0 6ZDZR0 11 )。
* 通讯作者(E-mail: wzc@henu.edu.cn; Tel: 0378-2868833-
3 7 6 7 )。
超低温保存技术可避免传统的种质保存过程
中易染菌和易发生遗传变异等诸多不利因素, 种质
保存具有长期性、稳定性、方便性等优势。目
前, 有关芽及分生组织的超低温保存大致有5种方
法: 慢冻法、快冻法、玻璃化法(vitrification)、包
埋 -脱水法(encapsulation-dehydration)和包埋 -玻璃
化法(encapsulation-vitrification)。其中, 玻璃化法
具有设备简单、易操作、保存后再生率高和重演
性好等优点而备受青睐, 已有很多成功的报道(王子
成和邓秀新 2001; 张玉进等 2001; 何艳霞 2007)。
玻璃化法是将生物材料以极高浓度的玻璃化溶液快
速脱水后, 直接投入液氮, 使生物材料连同玻璃化
溶液发生玻璃化转变, 进入玻璃态。其间水分子不
发生重排和不形成冰晶, 也不产生结构和体积的改
变, 因而不会对材料造成伤害(Br ison等 1997;
Pennycooke和 Towill 2000; Wang等 2003)。
近年来, 超低温保存细胞培养物的应用越来越
多, 但对小酸浆茎尖的超低温保存尚未见报道。本
文以玻璃化法对小酸浆茎尖的超低温保存技术进行
了初步探讨。
材料与方法
1 材料
小酸浆(Physalis minima L.)材料取自河南省宝
天曼国家级自然保护区的野生酸浆植株。选取酸
浆的幼嫩叶片为外植体, 选用继代培养基: MS+2.0
mol·L-1 6-BA+0.5 mol·L-1 IAA进行增殖培养。培
养基pH 5.8, 培养室温度(25±1) ℃, 光照强度30~40
µmol·m-2·s-1, 光照时间 12 h·d-1。
2 方法
实验参考文献(王子成和邓秀新 2001; 张永卓
和罗正荣2004)的方法对小酸浆茎尖进行超低温保
存。
2.1 预培养和预处理 选取继代培养 15~25 d植株
上带顶芽的茎段(长 0.5~1.0 cm), 于预培养基中培
养, 预培养时间分别设为 1、2、3、4、5 d, 预
培养基为MS+2 mol·L-1甘油+0.4 mol·L-1蔗糖+0.7%
琼脂。预培养后剥取茎段顶端 1.5~3 mm长的茎
尖, 置于 1.8 mL冷冻管中, 每管 10个茎尖, 加入预
处理液在室温下处理 30 min。预处理溶液成分为:
2 mol·L-1甘油 +0.4 mol·L-1蔗糖溶液。洗涤液成分
为: MS+1.2 mol·L-1蔗糖溶液。
2.2 玻璃化处理 用无菌枪头吸出预处理液, 加入玻
璃化溶液 PVS2 (protectant of vitrifiable solution)并
置于0 ℃冰水混合物中处理, 处理时间分别设为0、
50、60、70、80、90 min。PVS2成分为: 30%
甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0.4 mol·L-1蔗
糖。
2.3 超低温保存 迅速将冷冻管投入液氮中进行保
存, 保存时间分别设为 1、1 2、2 4、36、4 8、
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60 h。
2.4 化冻与恢复培养 茎尖分生组织细胞液泡小, 含
水量少, 采取快速化冻法, 即从液氮中迅速取出冷
冻管, 40 ℃水浴化冻处理 2~3 min, 除去保护液并
用洗涤液将茎尖洗涤 3次, 每次 10 min, 取出茎尖
置于无菌滤纸上以吸去残留在茎尖表面上的洗涤
液, 然后接种到恢复培养基上, 为了减少再培养中
的光抑制, 利于离体材料恢复生长, 暗培养 7 d后
再转移到正常光照条件下进行恢复培养。恢复培
养基成分为: MS+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA,
培养基 pH为 5.8。
实验结果
1 预培养时间对超低温保存前小酸浆茎尖的影响
对预培养不同时间的材料进行观察分析, 结果
表明: 茎尖存活率与培养时间具有一定的相关性。
成活率随着预培养时间的延长而呈现下降趋势(图
1), 特别是预培养 4 d之后, 茎尖表现出枯黄, 在6 d
时茎尖干枯死亡。这可能是由于甘油的过度渗透
造成细胞内环境的不良变化, 影响了细胞自身的代
谢活动, 继而导致茎尖死亡。
提高存活率。但这一作用又有一定的时间限定,
预培养时间过短会导致甘油渗透不充分, 致使茎尖
被冻死, 预培养时间过长则导致细胞过度脱水死
亡。
3 PVS2处理时间对超低温保存结果的影响
先用处理液(60% PVS2)对预培养的茎尖进行预
处理, 20~30 min后吸出处理液, 然后在0 ℃用100%
PVS2处理, 结果表明, 处理 70 min的茎尖成活率最
高, 达到 36%, 处理的时间更短或更长都不利于其
成活和再生(如处理 90 min时的成活率只有 11%),
而且往往会导致玻璃化不完全或 PVS2中毒(图 3)。
这可能说明, 冰冻保护剂PVS2的适时处理使茎尖内
组织迅速形成玻璃化状态, 从而避免了冰晶的形成
和减轻了伤害, 最终提高了保存后的成活率和再生
率。
图 1 预培养时间对超低温保存前小酸浆
茎尖成活率的影响
图 2 预培养时间对超低温保存后小酸浆
茎尖再生率的影响
图 3 PVS2处理时间对茎尖成活率的影响
4 液氮处理时间对超低温保存结果的影响
茎尖分别用液氮处理1、12、24、36、48、60 h
后, 观察茎尖成活率, 结果表明, 液氮处理时间的长
短对茎尖成活率的影响不大(图 4)。这可能是由于
在超低温状态下(-196 ℃)细胞生理代谢水平几乎降
为零, 时间梯度对实验结果已经没有意义所致。
2 预培养时间对超低温保存后茎尖再生率的影响
预培养后成活的茎尖进行超低温保存, 观察其
再生率的结果表明, 成活率与预培养时间密切相
关。其中, 预培养 3 d的茎尖的再生率最高, 达到
30%, 而茎尖在预培养 1和 2 d的情况下几乎没有
再生苗。随着预培养时间的延长, 茎尖的再生率又
逐渐呈下降趋势(图 2)。其原因可能是预培养时甘
油进入茎尖细胞内的同时也吸收细胞内的水分, 细
胞内的渗透压增高, 冰点降低, 从而起到保护作用,
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5 超低温保存后小酸浆的形态发生和再生
超低温保存后的茎尖洗涤后接种到恢复培养
基上, 暗室培养7 d, 转移到正常光照条件下继续培
养, 2周后成活的茎尖开始生长, 其长势良好, 没有
经过愈伤阶段而直接成苗。再生苗没有直接生根,
也能正常分化(图 5)。其他未成活的茎尖在暗培养
图 4 液氮处理时间对成活率的影响
图 5 小酸浆超低温保存过程
a: 恢复 1周后的茎尖; b: 恢复 6周后的茎尖; c: 经过继代的小酸浆; d: 移栽成活的小酸浆。
时褐化, 移至光照条件下后变黑死亡。超低温保存
后的再生苗与常温苗的形态指标一致, 表明玻璃化
法超低温保存技术保存小酸浆种质资源是合适的,
能够保证遗传资源的稳定性。
讨　　论
20世纪 70年代以来, 超低温保存的研究已取
得了很大进展。它为植物种质资源的保存开辟了
广阔的前景, 为园艺作物的品种改良、植物脱毒、
快速繁殖等方面奠定了基础(薛建平等2003; Wang
等 2003; 高霞等 2005)。超低温保存的茎尖恢复后
可直接生长成苗, 本研究结果表明, 小酸浆玻璃化
法保存后的成活率达到36%, 与其他植物相比还存
在着一定的差距(王子成和邓秀新 2001; 张永卓和
罗正荣 2004), 这种成活率的差异是物种间的区别
所致, 还是低温保存方法所致, 还有待于我们进一
步研究。
此外, 目前保存的材料多限于茎尖或芽, 其应
用范围有待于进一步扩大(吴雪梅和汤浩茹2005)。
相信今后的研究中, 超低温保存技术将会同低温生
物学、表观遗传学、医学生物技术等学科交叉渗
透, 并取得更大的进展。
参考文献
高霞, 张盛林, 李锡香(2005). 园艺植物茎尖玻璃化法超低温保存
技术研究. 北方园艺, (3): 77~78
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月984
何艳霞(2007). 拟南芥幼苗的超低温保存及其遗传变异研究[硕
士学位论文]. 开封: 河南大学
王子成, 邓秀新(2001). 玻璃化法超低温保存柑桔茎尖及植株再
生. 园艺学报, 28 (4): 301~306
吴雪梅, 汤浩茹(2005). 包埋玻璃化法超低温保存植物种质的研
究进展. 植物学通报, 22 (2): 238~245
薛建平, 张爱民, 柳俊, 石乐义(2003). 玻璃化法超低温保存地黄
茎尖. 农业生物技术报, 11 (4): 430~431
张永卓, 罗正荣(2004). 甜柿休眠芽茎尖包埋 -玻璃化法超低温
保存及植株再生. 中国农业科学, 37 (12): 2019~2022
张玉进, 张兴国, 庞杰, 刘佩瑛(2001). 魔芋茎尖玻璃化冻存研究.
作物学报, 27 (1): 97~102
Brison M, de Boucaud M-T, Pierronnet A, Dosba F (1997). Ef-
fect of cryopreservation on the sanitary state of a cv Prunus
rootstock experimentally contaminated with Plum Pox
Potyvirus. Plant Sci, 123: 189~196
Pennycooke JC, Towill LE (2000). Cryopreservation of shoot
tips from in vitro plants of sweet potato [Ipomoea batatas
(L.) Lam.] by vitr ifica tion. Plant Cell Rep, 19: 733~
737
Wang Q, Mawassi M, Li P, Gafny R, Sela I, Tanne E (2003).
Elimination of grapevine virus A (GVA) by cryopreservation
of in vitro-grown shoot tips of Vitis vinifera L. Plant Sci, 165:
321~327