全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 9期, 2010年 9月 953
收稿 2010-05-21 修定 　2010-06-18
资助 国家自然科学基金(30 9 00 9 7 3)。
* 通讯作者(E-mail: wzc@henu.edu.cn; Tel: 0378-2868833
-3 7 6 7 )。
玻璃化法超低温保存蛇莓茎尖
薄涛, 王子成 *, 柴星星
河南大学生命科学学院, 河南开封 475004
提要: 本文采用玻璃化法对蛇莓离体茎尖超低温保存进行了初步探讨。研究了低温锻炼时间、预培养时间、预处理时间、
玻璃化液处理时间和液氮保存时间对超低温保存后成活率的影响。经优化, 蛇莓的最高成活率可达(42.00±2.74)%。
关键词: 蛇莓; 茎尖; 超低温保存; 玻璃化; 成活率
Cryopreservation of Duchesnea indica (Andr.) Focke Shoot-Tips by Vitrifica-
tion
BO Tao, WANG Zi-Cheng*, CHAI Xing-Xing
College of Life Science, Henan University, Kaifeng, Henan 475004, China
Abstract: A procedure had been studied on cryopreservation of Duchesnea indica (Andr.) Focke shoot-tips in
vitro by vitrification. The influence of the treatment periods of cold temperature acclimation, pre-culture,
pretreatment, PVS2 and cryopreservation in liquid nitrogen on survival rate after cryopreservation was studied.
The best survival rate reached to (42.00±2.74)%.
Key words: Duchesnea indica; shoot-tip; cryopreservation; vitrification; survival rate
蛇莓为蔷薇科蛇莓属多年生宿根型双子叶草
本植物, 最早的记载出现于《别录》, 别名宝珠草
等(祝丽香 2004)。在我国东部、南部、西南部
和中部等绝大区域都有分布(陈明 2008)。蛇莓的
叶、花、果具有较高的观赏价值, 具有广泛的适
应性和较强的抗逆性, 可被应用于城市园林绿化, 是
公认的较有推广应用价值的野生花卉和乡土地被植
物(叶嘉等 2008)。另外, 蛇莓常用作草药, 具有多
种功效。除上述两方面外, 对蛇莓的研究还存在于
化学成分分析、病理毒理研究等方面(王海英和张
翠2009)。但有关蛇莓种质资源保存的研究尚未见
报道。本文采用玻璃化法对蛇莓离体茎尖的超低
温保存技术进行了初步研究。
材料与方法
1 植物材料
供试材料蛇莓[Duchesnea indica (Andr.) Focke]
采集于河南省宝天曼国家级自然保护区。
2 超低温保存条件的筛选
参照王子成和邓秀新(2001)的处理方法并稍加
改动。每步处理均以上步最佳条件为基础。具体
操作步骤如下。
2.1 低温锻炼时间的筛选 将继代生长30 d的试管
苗置于 4℃冰箱中低温锻炼 0、1、2、3、4、
5 和 6 周。
2.2 预培养时间的筛选 取试管苗, 在无菌条件下切
取 1~2 mm茎尖, 置于固体预培养培养基中室温培
养 1、2、3、4、5、6和 7 d。固体预培养培养
基为MS+2 mol·L-1甘油 +0.4 mol·L-1蔗糖 +7 g·L-1琼
脂, pH值为 5.8。
2.3 预处理时间的筛选 将经过预培养的材料转入
无菌冷冻管中, 并加入液体预处理培养基, 在20 ℃
下处理 10、20、30、40、50、60 和 70 min。
液体预处理培养基为MS+2 mol·L-1甘油+0.4 mol·L-1
蔗糖, pH值为 5.8。
2.4 玻璃化保护剂处理时间的筛选 用无菌胶头滴
管吸出液体预处理培养基, 加入玻璃化保护剂 2
(protection of vitrifiable solution 2, PVS2)。在冰水
混合物中处理 30、50、70、90、110、130 和
技术与方法 Techniques and Methods
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150 min后, 换成新鲜PVS2。PVS2成分为MS+30%
(W/V)甘油+15% (W/V)乙二醇+15% (W/V) DMSO+
0.4 mol·L-1 蔗糖, pH值为 5.8。
2.5 液氮处理时间的筛选 将装有新鲜PVS2和材料
的冷冻管装入自制纱布袋中, 迅速投入液氮, 保存
1、12、24、48、72、96 和 120 h后, 将冷冻
管从液氮中取出。将冷冻管立即放入40 ℃水浴锅
中, 迅速化冻 1 min。除去 PVS2, 20 ℃下用含 1.2
mol·L-1蔗糖的MS盐洗涤液洗涤3次, 每次10 min。
然后取出茎尖, 用无菌滤纸吸去残留在其表面的洗
涤液, 接种到再生培养基上。再生培养基为MS+
1.0 mg·L-1 GA3+1.0 mg·L-1 6-BA+30%蔗糖 +0.7%
琼脂, pH值为 5.8。暗处理 4 d后, 转移到正常条
件下, 培养温度为(24±1) ℃, 光照周期为 12 h·d-1。
7 d后统计成活率。成活率=(玻璃化超低温保存后
成活的茎尖数 /保存的总茎尖数)×100%。
实验结果
1 低温锻炼对超低温保存离体茎尖成活率的影响
经过超低温保存后发现, 适当低温锻炼能显著
影响保存后茎尖的存活率。由图 1可知, 未经低温
锻炼的茎尖保存后存活率仅为(7.00±2.74)%; 锻炼
4周时达到最高, 成活率达到(28.00±5.70)%。随锻
炼时间继续延长, 保存后茎尖存活率呈现下降趋
势。当锻炼达到 5~6周时, 试管苗逐渐变黄脱叶,
保存后的成活率显著下降, 分别降至(19.00±6.52)%
和(3.00±4.47)%。低温锻炼属于胁迫的一种, 能够
诱导一些和抗冻有关的基因表达, 产生抗冻蛋白和
其他保护机制 , 提高植物的抗冻性(李广武等
1998)。试验时, 低温锻炼是在 4 ℃冰箱内进行的,
随着时间的延长, 蛇莓得不到充足的光照, 使得其
生活力减弱, 可能是造成超低温保存后成活率降低
的因素。
2 预培养时间对超低温保存离体茎尖成活率的影响
从锻炼 4周的蛇莓上切去 1~2 mm长的茎尖,
将其转入固体预培养培养基, 观察不同处理时间对
茎尖存活率的影响。发现室温条件下, 预培养对提
高超低温保存后茎尖的成活率有显著作用。在预
培养过程中发现, 随时间的延长保存前茎尖的生活
力已经出现变化。预培养 3 d时, 开始有个别茎尖
变成黄绿色; 到 7 d时只有个别茎尖呈黄绿色, 大
部分变为褐色。结果表明, 茎尖成活率随预培养时
间的延长呈现先升高后降低的趋势(图 2)。预培
养4 d后, 超低温保存效果最好, 成活率达到(33.00±
5.70)%。
图 1 低温锻炼对离体茎尖超低温保存成活率的影响
Fig.1 The effect of acclimation periods on survival rate of
cryopreserved shoot-tips in vitro
图中不同小写字母表示 0.05 水平的显著性, 下图同。
图 2 预培养时间对离体茎尖超低温保存成活率的影响
Fig.2 The effect of pre-culture periods on survival rate of
cryopreserved shoot-tips in vitro
3 预处理时间对超低温保存离体茎尖成活率的影响
将低温锻炼 4周, 预培养 4 d的材料用于试
验。将液体预处理培养基装入灭菌的冷冻管中, 实
验材料在其中处理不同的时间。由图 3可知, 随着
处理时间的延长, 成活率呈现先增加后减小的趋
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势。在处理 30 min时, 成活率最高, 达(38.00±
4.47)%。预培养和预处理的目的都是使茎尖脱水,
增加含糖量, 提高胞液的渗透势, 降低冰点, 这样能
够减少冻存过程中水分结冰对细胞膜的伤害; 但过
量的脱水同样会对细胞造成伤害, 降低存活率(王子
成和邓秀新 2004)。
的延长, 保存后茎尖存活率逐渐提高。70 min时
最高, 由最初处理 30 min的(21.00±2.24)%提高到
(42.00±2.74)%。随处理时间的继续延长, 成活率又
逐渐下降, 150 min时成活率下降到(17.00±5.70)%。
由于DMSO具有很强的毒性, 可对茎尖造成伤害,
所以处理时间长短是影响保存后成活率的关键因
素。时间过短起不到保护效果, 时间过长毒害作用
严重, 两者都可以造成保存后成活率的降低(张玉进
等 2001)。
5 液氮处理时间对离体茎尖超低温保存成活率的
影响
将低温锻炼 4周, 预培养 4 d, 预处理 30 min,
PVS2处理 70 min的蛇莓用于试验。观察液氮冻存
时间对茎尖成活率的差别。结果表明, 冻存时间对
超低温保存后离体茎尖成活率无明显影响, 成活率
均在 40%左右(图 5)。方差分析发现, 各处理间不
存在统计学差别。在液氮冻存过程中, 茎尖的代谢
过程处在几乎停滞状态, 不会对起产生巨大影响, 因
此, 冻存时间不会影响最终的成活率。图 3 预处理时间对离体茎尖超低温保存成活率的影响Fig.3 The effect of pretreatment periods on survival rate of
cryopreserved shoot-tips in vitro
4 玻璃化保护液处理时间对离体茎尖超低温保存
成活率的影响
将低温锻炼 4周, 预培养 4 d, 预处理 30 min
的材料用于试验。由图 4可知, 随 PVS2处理时间
图 4 PVS2处理时间对离体茎尖超低温保存成活率的影响
Fig.4 The effect of PVS2 treatment periods on survival rate
of cryopreserved shoot-tips in vitro
图 5 液氮处理时间对离体茎尖超低温保存成活率的影响
Fig.5 The effect of liquid nitrogen treatment periods on
survival rate of cryopreserved shoot-tips in vitro
讨　　论
结果表明, 切取 4 ℃低温锻炼 3~4周, 生长健
壮的蛇莓茎尖 1~2 mm, 在室温下固体预培养培养
基上培养 4 d后, 转入无菌冷冻管。向冷冻管中加
入液体预处理培养基, 于 20 ℃处理 20~30 min; 用
PVS2取代液体预处理培养基, 于0 ℃处理50~70 min
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后, 换成新鲜PVS2, 快速投入液氮中保存 1 h, 于40
℃水中快速解冻 1 min, 洗液洗涤3次, 每次10 min,
取出茎尖, 接种到再生培养基。暗培养 4 d后, 转
入光照培养, 7 d后统计存活率, 最高存活率可达
(42.00±2.74)%。
超低温保存技术与其他保存技术相比具有明
显的优点, 如保存时间长, 遗传稳定性好, 操作方便
等。常用的超低温保存方法有 5种: 慢冻法, 快冻
法, 玻璃化法, 包埋 -脱水法和包埋玻璃化法。其
中, 玻璃化法操作相对简便, 设备要求简单而倍受
青睐。运用玻璃化法已有保存成功的例子, 如小酸
浆(Physalis minima, 曲先等 2008)、罗汉果(Siraitia
grosvenori, 刘华英和覃灵华 2009)、月季(Rosa
chinensis, 王秋竹等 2009)、树莓(Rubus swinhoei,
娄汉平等 2009)、银条(Stachys floridana, 宋尚伟
等 2009)、甘薯(Dioscorea esculenta, 张江丽等
2008)等 30多种植物。玻璃化法是将材料经高浓
度玻璃化溶液脱水后, 直接将生物材料和玻璃化溶
液投入液氮, 使其进入玻璃化。此过程中水不会形
成冰晶对细胞造成伤害(Brison等1997; Pennycooke
和Towill 2000)。超低温保存的茎尖经后处理直接
成苗, 本研究结果表明, 蛇莓玻璃化法保存后的成
活率最高可到(42.00±2.74)%, 与已报道的其他植物
相比还存在一定差距(Brison等1997; 王子成和邓秀
新 2001), 这种差距存在的原因是不同物种的差别
所致, 还是超低温保存操作所致, 或是后处理条件
不合适所致, 还有待进一步研究。
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