全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 533
拟南芥DREB 1A转录因子的原核表达和多克隆抗体制备
范玉清 1,2，刘恒 1,3，任伟 1，夏光敏 1,*
1山东大学生命科学学院细胞工程遗传研究所，济南 250100；2山西长治学院生物化学系，山西长治 046011；3山东
中医药大学基础医学院分子生物学实验室，济南 250014
Prokaryotic Expression of Arabidopsis thaliana DREB 1A Transcriptor and
Preparation of Its Polyclonal Antibody
FAN Yu-Qing1,2, LIU Heng1,3, REN Wei1, XIA Guang-Min1,*
1Plant Cell Engineering and Genetic Institute, School of Life Science, Shandong University, Jinan 250100, China; 2Biology and
Chemistry Department of Changzhi College, Changzhi, Shanxi 046011, China; 3Molecular Biology Laboratory, College of Basic
Medicine, Shandong Traditional Chinese Medicine University, Jinan 250014, China
提要：采用 PCR技术，从质粒 pCAMBIA 1301/DREB 1A中扩增拟南芥DREB 1A转录因子的编码序列，并将其插入原
核表达载体 pGEX-4T-1中诱导表达，获得分子量约 50.4 kDa 的融合蛋白，经融合蛋白纯化酶切后免疫家兔获得 DREB
1A转录因子特异性的多克隆抗体，经酶联免疫吸附测定表明，所制备的多克隆抗体的稀释倍数为 25 600时，显色仍清
晰可见。
关键词：拟南芥DREB 1A转录因子；原核表达；多克隆抗体；酶联免疫吸附测定
收稿 2007-03-29 修定　 2007-05-28
资助　 国家转基因专项基金(2003/5250322)和国家基础研究
发展计划(973 计划) (2006CB100100)。
* 通讯作者(E-mail：xia gm@sdu.edu.cn；Tel：053 1-
8 6 3 3 3 6 7 9 )。
运用现代分子生物学技术，阐明植物抗逆机
制，获得抗逆性状优良的品种十分重要。脱水应
答元件结合蛋白(dehydration responsive element
binding protein，DREB)的发现是近年来植物抗逆
研究中最具突破性的进展(王少峡等 2004)。植物
转录因子DREB在干旱、高盐及低温胁迫信号传
递中起重要作用，它能与脱水应答元件
(dehydration responsive element，DRE)特异结合
(Gilmour等 1998)，在低温、干旱、高盐胁迫条
件下调控有关的功能基因的表达，且表达不依赖
ABA信号转导途径。DREB转录因子的基因陆续
从各种植物中得到克隆，在GenBank中公布的就
达 70多个，DREB基因家族得以不断丰富和完
善。在DREB转基因植物中，DREB转录因子基
因的过量表达可以激活靶基因的表达，提高植物
对低温、干旱等逆境的忍耐力( L i u 等 1 9 9 8；
Dubouzet等 2003；Qin等 2004；Seki等 2003)。
转录因子能特异结合DRE/CRT顺式作用元件，调
控启动子中含有DRE/CRT元件的一类逆境应答基
因的表达，增强植物对多种逆境的抵抗和适应能
力，这对从整体上增强植物的抗逆性，提高其稳
产性，有巨大的应用前景。因此采用转录因子改
良植物抗逆性，可能会获得较为理想的综合效
果。
现已从拟南芥中克隆及鉴定的DREB基因有2
大类，即 DREB 1类和 DREB 2类，1类分别命
名为DREB 1A、DREB 1B和 DREB 1C；2类分
别命名为DREB 2A和DREB 2B (Liu等 1998)。本
文中所用的DREB 1A基因来自拟南芥。用特异性
引物从质粒pCAMBIA 1301/DREB 1A上PCR扩增
DREB 1A转录因子的编码序列，构建了DREB 1A
原核表达载体。纯化制备蛋白免疫家兔获得多克
隆抗体，酶联免疫吸附测定(ELISA)检测表明其具
有多抗的效价。
材料与方法
1 材料与试剂
质粒pCAMBIA 1301/DREB 1A由清华大学刘
强先生惠赠，pCAMBIA 1301 质粒是 Ti 质粒
(tumor-inducing plasmid，瘤诱导质粒)，因此它
具有卡那霉素抗性(KanR)和潮霉素抗性(HygR)。原
核表达载体 pGEX-4T-1为融合载体，其主要特征
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是：IPTG 诱导的强启动子、谷胱甘肽硫转移酶
(glutathione S-transferase，GST)基因、凝血酶
(thrombin)切割序列、氨苄青霉素抗性(AmpR)、
lacIq等位基因、胞质表达GST-融合蛋白、直接
进行 5 pGEX 或 /和 3 pGEX 测序。大肠杆菌
(Escherichia coli)表达菌株 BL21 (DE3) (由我们实
验室保存)是一种表达菌株，其染色体上带有阻断
DE3区中 T7 1基因转录的 lacI基因，具有氯霉素
抗性(CmlR)。实验兔为纯种新西兰雄性兔(体重
2.0~2.5 kg)，购自山东省农业科学院。主要试剂
购自大连宝生物公司和上海生工公司。
2 pGEX-4T-1/DREB 1A原核表达载体的构建
从含pCAMBIA 1301/DREB 1A的大肠杆菌中
提取质粒，用上游引物 5 TAGGATCCATGAA-
CTCATTTTCTGCTT 3 (划线处为 BamHI位点)和
下游引物5 GCGAATTCTTAATAACTCCATAACG
3 (划线处为EcoRI位点)进行 PCR扩增，得到 667
bp的DREB 1A基因编码序列；BamHI和EcoRI酶
切，琼脂糖凝胶电泳分离后，用凝胶回收试剂盒
(购自大连宝生物)纯化回收，定向插入原核表达
载体 pGEX-4T-1，构建成GST-DREB1A融合蛋白
表达重组载体 pGEX-4T-1/DREB 1A，用重组载体
转化感受态菌株 BL21 (DE3)，提取质粒后酶切鉴
定重组体，并 DN A 测序验证。
3 融合蛋白的原核表达
挑取经鉴定的阳性单菌落，接种至含 1 0 0
µg·mL-1氨苄青霉素和 170 µg·mL-1氯霉素的 LB培
养液，37 ℃振荡培养过夜。次日，以 1:100的
体积比接种于另一新鲜的含抗生素的LB液体培养
基，继续培养至 OD 600约为 0.6，用终浓度为 1
mmol·L-1的 IPTG于 37 ℃下诱导8 h后，以12 000×g
离心 1 min收集菌体。沉淀悬于 100 µL 1×SDS-
PAGE上样缓冲液[50 mmol L-1 Tris·HCl (pH 6.8)、
100 mmol L-1 DTT、2% SDS、0.1% 溴酚蓝、
10%甘油]，100 ℃下加热3 min，室温下以12 000×g
离心 1 min。用 SDS-PAGE电泳检测，分离胶浓
度为 12 %。
4 融合蛋白状态的确定
离心诱导菌液，以 PBS (0.14 mmol L-1 NaCl、
0.0027 mmol L-1 KCl、0.01 mmol L-1 Na2HPO4、
0.0018 mmol L-1 KH2PO4，pH 7.3)重悬菌体[50
µL·mL (菌液)]。于冰水上以超声波(500 W；5 s
间歇，5 s超声波，共 10 min)裂解菌体，离心
后分别收集上清液和沉淀，进行 SDS-PAGE电
泳，证实融合蛋白是否以包涵体形式存在。
5 包涵体的纯化
裂解菌体后，包涵体纯化参照 Saito等(1987)
和Bartholomé-De Belder等(1998)文中的方法进行。
纯化后的包涵体经脲变性，Tris碱缓冲液透析，
冷冻干燥后存于-20 ℃备用。
6 多克隆抗体的制备
根据谷胱甘肽琼脂糖凝胶( G l u t a t h i o n e
Sepharose)TM 4B (Amersham-Pharmcia Biotech)说明
书，于 23 ℃凝血酶消化GST/DREB 1A融合蛋白
3 h，消化产物经 SDS-PAGE电泳分离回收DREB
1A蛋白。纯化的DREB 1A蛋白(200 µg·mL-1)加
入1.5倍体积的磷酸盐缓冲生理盐水和弗氏完全佐
剂，研磨使其相互融合达到油包水状态。采用多
点皮内注射免疫健康新西兰兔，14 d后加强免疫
(佐剂为弗氏不完全佐剂) 1次，以后每隔 9 d加
强免疫(佐剂为弗氏不完全佐剂) 5次。10 d后，
从耳静脉取血。
7 抗体效价的鉴定
以酶联免疫吸附实验(ELISA)检测抗体效价，
抗原DREB 1A用包被液(0.05 mol L-1碳酸盐缓冲
液，pH 9.6)稀释至 50 µg·mL-1，每凹孔加 100 µL，
包被反应孔以 2% BSA封闭，免疫前的兔抗血清
为阴性对照，免疫后的兔抗血清依 2倍稀释分别
加入包被的反应孔中，二抗为辣根过氧化物酶标
记的羊抗兔抗体(1:2 000)，用NBT/BCIP染色试剂
盒(华美生物工程公司)显色。整个反应的洗涤液
为 0.01 mol L-1 0.05% PBS-Tween-20 (pH 7.4)。
实验结果
1 pGEX-4T–1/DREB 1A原核表达载体的构建和
鉴定
以pCAMBIA 1301/DREB 1A质粒为模板，用
设计的特异引物PCR扩增出约667 bp的DNA片段
(图 1)，与预期的片段长度相符。回收产物后，
用引物引入的 BamHI和 EcoRI位点，将其插入原
核表达载体 pGEX-4T-1相应的酶切位点，转化大
肠杆菌 BL21 (DE3)。酶切鉴定出阳性克隆(图 2)，
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结果表明，构建的重组质粒pGEX-4T-1/DREB 1A
阅读框正确。
2 融合蛋白GST-DREB 1A的诱导表达
IPTG诱导后的大肠杆菌BL21 (DE3)的细胞粗
提物进行SDS-PAGE的结果(图 3)显示，对照菌株
(BL21/pGEX-4T-1)表达了 26.2 kDa的GST特异条
带，而重组菌株(pGEX-4T-1/DREB 1A)呈现出一
条新蛋白条带，其大小与融合蛋白(GST-DREB
1A)的大小(50.4 kDa≌26.2 kDa+24.2 kDa)相一致，
表明插入的外源基因片段已经成功地在大肠杆菌中
表达，并与 G ST 形成融合蛋白。
图 1 DREB 1A的PCR扩增
　　M：λDNA HindIII/EcoRI 双酶切 DNA标准；1：PCR 扩
增产物。
图 2 pGEX-4T-1/DREB 1A的酶切鉴定
　　M：λDNA HindIII/EcoRI 双酶切 DNA标准；1：pGEX-
4 T -1；2：阳性克隆质粒；3：Ec o RI 酶切 pG EX-4 T -1；4：
EcoRI 酶切阳性克隆质粒；5：BamHI 酶切阳性克隆质粒；6：
BamHI/EcoRI 酶切阳性克隆质粒；7：DREB 1A的 PCR产物。
3 融合蛋白GST-DREB 1A的纯化
诱导后的菌体进行超声波破碎、离心后，沉
淀和上清液分别进行 SDS-PAGE，融合蛋白主要
存在于沉淀中，说明融合蛋白是以包涵体形式存
在于细胞中的(图 4)，因此必须纯化。SDS-PAGE
分析表明，包涵体经纯化后，考马斯亮蓝染色仅
显示出GST-DREB 1A融合蛋白一条带，没有其
它蛋白条带(图 5)。
图 4 诱导后破碎离心的 pGEX-4T-1/
DREB 1A的 SDS-PAGE
　　1：对照菌体(BL2 1/pG EX-4 T-1)蛋白；2：pG EX-4 T-1/
D REB 1 A 菌体蛋白；3：BL2 1 菌体上清液；4：BL2 1 菌体
沉淀；5、6：pGEX-4T-1/DREB 1A菌体上清液；7：pGEX-
4T-1/DREB 1A菌体沉淀。
图 3 IPTG诱导后融合蛋白的 SDS-PAGE
　　M：低分子量蛋白标准；1：IPTG诱导 4 h的 BL21/pGEX-
4T-1 菌体蛋白；2：IPTG 诱导前的 pGEX-4T-1/DREB 1A菌
体蛋白；3~13：IPTG 诱导 1~11 h的 pGEX-4T-1/DREB 1A
菌体蛋白。
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异性强，灵敏度高，在稀释倍数为 25 600时仍能
看到显色信号，说明达到了抗体制备的要求。
讨　　论
通过基因工程手段构建的原核表达质粒
pGEX-4T-1/DREB 1A结构正确，未出现核苷酸的
移码和突变。在 IPTG诱导下GST-DREB 1A可稳
定而高效表达并以包涵体形式存在于表达菌株的细
胞中。如果表达靶蛋白的目的只是用于产生抗
体，则不需要获得活性蛋白，包涵体的形成可使
得目的蛋白易于纯化且成本下降。用凝血酶切割
获得的靶蛋白 DREB 1A用于免疫家兔获得效价
高、特异性强的抗 DREB 1A的多克隆抗体。在
免疫家兔时，为避免抗原产生副作用及对动物的
损坏，第一次免疫用弗氏完全佐剂，随后的免疫
均采用弗氏不完全佐剂。我们实验室制备的多抗
比进口的造价低，还可用于免疫荧光、石蜡切片
等(Comijn等 2001)。用本文方法制备的DREB 1A
多克隆抗体我们正准备用于转基因小麦DREB 1A
基因表达的Western印迹检测。
参考文献
王少峡, 王振英, 彭永康(2004). DREB转录因子及其在植物抗逆
中的作用. 植物生理学通讯, 40 (1): 7~13
图 5 纯化后融合蛋白GST-DREB 1A的 SDS-PAGE
　　M：低分子量蛋白标准；1：IPTG诱导 4 h的 BL21/pGEX-
4T-1 菌体蛋白；2：IPTG 诱导 4 h的重组菌体蛋白；3：BL2 1
菌体蛋白；4~6：分别为第 1 次 27%蔗糖溶液 12 0 00×g 离心
后的蔗糖溶液、上清和沉淀；7、8：第 2 次 2 7 % 蔗糖溶液
12 00 0×g 离心后的上清和沉淀；9、10：第 3 次 12 00 0×g 离
心后的上清和沉淀；11、12：第 4 次 12 00 0×g 离心后的上清
和沉淀；13：第 5次 12 000×g离心后的上清；14：8 mol·mL-1
的脲溶解包涵体后 2 0 0 0 0 × g 离心后的沉淀；1 5、1 6：8
mol·mL-1的脲溶解包涵体后 20 000 ×g 离心后的上清。
图 6 凝血酶切割融合蛋白的 SDS-PAGE
　　M：低分子量蛋白标准；1：凝血酶切割融合蛋白 G S T -
DREB 1 A。
图 7 抗血清 ELISA的结果
　　第 1列 B和 C、D和 E、F和 G行每孔仅加 100 µL包被液
(无抗原)，分别加 5号兔、3号兔和 2号兔抗血清(稀释倍数 800) ；
第 2列 B和 C、D和 E、F和 G 行每孔加 100 µL (50 µg·mL-1)
抗原，分别加 5 号兔、3 号兔和 2 号兔免疫前血清(稀释倍数
2 0 0 ) ；第 3 ~ 1 2 列 B 和 C、D 和 E、F 和 G 分别为 5 号兔、3
号兔和 2 号兔抗血清不同的稀释倍数，3~12 的稀释倍数分别为
1 0 0、2 0 0、4 0 0、8 0 0、1 6 0 0、3 2 0 0、6 4 0 0、1 2 8 0 0、
25 60 0、51 20 0。
4 融合蛋白GST-DREB 1A的切割获得
用完整的DREB 1A蛋白作抗原，需要提高融
合蛋白配偶体，即提高GST羧基端的牛凝血酶识
别位点的切割效率。凝血酶切割融合蛋白的SDS-
PAGE结果(图6)表明：酶切温度为23 ℃和酶切时
间3 h的GST羧基端的凝血酶识别位点的切割效率
最高，可获得大量的全长 DREB 1A蛋白。可直
接从SDS-PAGE胶上切割靶蛋白DREB 1A用作抗
原免疫家兔。
5 抗体的特异性分析
经DREB 1A抗原免疫新西兰兔获得的抗血清，
以 ELISA分析的结果(图 7)表明，ELISA检测显色
反应的信 /噪比大，效果好；所制备的抗血清特
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Bartholomé-De Belder J, Nguyen-Disteche M, Houba-herin N,
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