全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 6期，2008年 12月1146
菠萝果实 cDNA文库的构建
张秀梅, 孙光明, 杜丽清, 魏长宾, 刘忠华, 谢江辉 *
中国热带农业科学院南亚热带作物研究所, 广东湛江 524091
提要: 以菠萝幼果为研究材料, 采用CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit技术构建菠萝幼果 cDNA文库, 其文
库的库容量为 1.01×106, 重组率为 92%, PCR检测表明大多数插入片段均大于 1 000 bp。
关键词: 菠萝; 果实; cDNA文库
Construction of the cDNA Library from Pineapple Fruit
ZHANG Xiu-Mei, SUN Guang-Ming, DU Li-Qing, WEI Chang-Bin, LIU Zhong-Hua, XIE Jiang-Hui*
South Subtropical Crop Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Science, Zhanjiang, Guangdong 524091,
China
Abstract: Total RNAs were extracted from the pineapple fruit using plant total RNA extraction kit, and full-
length cDNA library was constructed with SMART cDNA Library Construction Kit. The capacity of the pri-
mary library was 1.01×106, in which 92% clones were recombinant and all of the inserted cDNA fragments
were larger than 1 000 bp. The positive signals were detected by PCR in the amplified library. The data indicated
that the cDNA Library had high quality, and provided a useful tool for cloning glucose metabolism genes and
further study on the molecular mechanisms of its biosynthesis.
Key words: pineapple; fruit; cDNA library
收稿 2008-09-12 修定 2008-10-22
资助 “948”项目[2006-G34(A)]、农业部行业计划(nyhyzx07-
030)、中国热带农业科学院基金(Rky0439)和中央级公
益性科研院所基本科研业务费专项(200701)。
* 通讯作者(E-mail: Xiejianghui@21cn.com; Tel: 0759-
2 8 5 8 1 6 8 )。
从总体上讲, 我国菠萝果实品质差、产量低
和育种落后。生产中的主要品种多是从国外引进,
在国际果品市场上难以形成自己的特色和竞争优
势。选育适合中国特色的品质好、抗性强的新品
种, 降低生产成本, 提高经济效益, 是我国菠萝产业
化进一步发展的根本出路。而基因工程技术可能
为实现这一目标提供契机。
分离和克隆基因是基因工程技术应用的基础,
cDNA文库是发现新基因和研究基因功能的基础工
具, 在生物学研究领域中有着较广泛的用途, 目前
已发现的基因绝大部分是通过cDNA文库筛选而得
到的(晏慧君等 2006)。因此, 构建菠萝果实 cDNA
基因文库, 为分离与果实品质、产量和抗性等相关
的基因奠定了基础。
材料与方法
菠萝品种 ‘巴厘 ’[Ananas comosus (L.) Merr.
cv. Yellow Mauritius]的幼果采自湛江南亚热带作物
研究所菠萝圃。文库构建试剂盒 C r e a t o r T M
SMARTTM cDNA Library Construction Kit (Catlog #:
634901)是 Clontech公司产品。感受态细胞为大肠
杆菌 Electro-Cells DH5α、DL2000 DNA分子量标
准和D2215 DNase (RNase-Free) 购自TaKaRa生物技
术公司。
RNA提取采用天为时代的 RNAplant植物
RNA提取试剂, 并用紫外分光光度计测定RNA的
浓度和纯度。取 1 µL总 RNA进行琼脂糖凝胶电
泳, 在凝胶成像系统上观察结果。
文库构建采用 Clontech公司的 Creator TM
SMARTTM cDNA Library Construction Kit, 按说明书
上的操作。取 3.0 µL总 RNA进行反转录, 合成
cDNA第一链, 反应体系 10 µL, 反应结束取 2.0 µL
cDNA第一链产物进行 LD PCR扩增, 取 5 µL用
1.1%TAE琼脂糖凝胶进行电泳检测。纯化回收
cDNA, 用 SfiI于 50 ℃酶切 2 h, 产生粘性末端。
酶切产物 100 µL与 2.0 µL 1%二甲苯胺过 SPIN-
400柱, 每管过柱收集 35 µL, 取 5 µL用于电泳检
测。双链 cDN A 片段化后, 取 1 .0 µL 连接到
pBluescript II SK的改造载体上, 然后将含有cDNA
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的质粒载体转化到用 CaCl2法制备的感受态细胞
DH5α 中。
文库的质量检测, 根据蓝白斑培养、筛选结
果来计算文库的库容量(Lambert和Willamson 1993)
和文库的重组率(苟小平等 2001; Dresselhaus等
1994)。通过随机挑取 24个单菌落培养, 进行菌液
PCR鉴定, 确定插入片段的大小。文库质量检测
后,向转化细胞中加入40%的甘油, 混匀后放入-80
℃冰箱中保存。
结果与讨论
1 菠萝总RNA的提取及质量鉴定
采用天为时代的 RN Apla nt 提取菠萝幼果
RNA。获得的RNA经紫外分光光度计检测结果为
OD260 nm/OD280 nm=1.749, 分离提取的RNA浓度为
0.502 µg·µL-1。琼脂糖电泳结果显示 18S和 28S条
带清晰, 且 28S rRNA的亮度高于 18S rRNA的 2
倍多(图 1), 无拖尾现象。说明所提取的RNA没有
图 1 菠萝果实中总RNA琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 Agarose gel electrophoretogram of total RNAs from
pineapple
图 2 cDNA琼脂糖凝胶电泳
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of Ds cDNAs
Marker为 Gibco/BRL公司的 1 kb DNA ladder。
图 3 分级后 cDNA片段琼脂糖凝胶电泳
Fig.3 Agarose gel electrophoresis of cDNA segments after fractionation
1~10: 分级后的 cDNA片段; Marker为 Gibco/BRL公司的 1 kb DNA ladder。
降解, RNA分子完整性较好, 能够满足 cDNA合成
的需要。
2 双链 cDNA合成及纯化回收
植物mRNA的大小一般集中分布在 0.5~4 kb,
因此反转录后的全长cDNA大小也应该分布在该范
围内, 才能说明构建的 cDNA包含全长的 cDNA。
由图 2可知, 合成的双链 cDNA是一个大小分布在
0.5~4 kb的弥散条带, 在接近 1 kb附近有非常明亮
清晰的条带,说明 cDNA比较完整。
再用蛋白酶K消化和SfiI酶切, 将酶切产物经
过 SPIN-400 Column片段化后, 电泳检测片段化结
果(图 3), cDNA片段主要就集中在第 1到 5管, 混
合 1到 5管的过柱产物用于连接。
在构建cDNA文库过程中, 分级分离去除小于
500 bp的 cDNA片段很重要。如果不能有效的去
除小片段, 会优先与载体连接, 使插入片段的平均
长度过短, 则文库的应用价值降低。但过多的筛除
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cDNA片段, 势必会造成原始文库的库容量降低, 影
响文库的质量。本试验合并了 1~5管的 cDNA样
品, 收到良好的效果。
3 cDNA文库的质量检测
文库的库容量、重组率及插入片段的大小是
鉴定 cDNA文库质量的重要指标。一般文库的库
容量达到 2.07×105以上为有效的文库(曹必好等
2002; 王劲等 2003)。经过初步鉴定, 本研究获
得的菠萝幼果中 cD NA 原始文库的库容量为
1.01×106, 基本上能够保证从这个文库中筛选到低
拷贝的基因。
从扩增文库中随机挑取24个克隆进行PCR鉴
定, 此文库的重组率为 92%, 且插入片段一般都大
于 1 000 bp (图 4), 说明构建的文库质量较高。
图 4 cDNA文库随机插入片段的 PCR检测
Fig.4 PCR analysis of randomly inserted fragments in cDNA library
Marker为 TaKaRa公司的DL2000; 1~24: 插入片段。
参考文献
曹必好, 雷建军, 宋洪元, 宋明, 杨朝辉(2002). 结球甘蓝 cDNA文
库的构建和鉴定. 园艺学报, 29 (6): 579~580
苟小平, 徐莺, 唐琳, 杨钫, 陈放(2001). 水稻精细胞的 cDNA文
库构建及分析. 植物学报, 43 (10): 1093~1096
王劲, 袁旭, 李旭峰(2003). 芥蓝 cDNA文库的构建及文库质量检
测. 四川大学学报(自然科学版), 37 (Sup): 76~79　
晏慧君, 黄兴奇, 程在全(2006). cDNA文库构建策略及其分析研
究进展. 云南农业大学学报, 2 (1): 1~6
Dresselhaus T, Lorz H, Kranz E (1994). Representative cDNA
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Lambert KN, Williamson VM (1993). cDNA library construction
from small amounts of RNA using paramagnetic beads and
PCR. Nucleic Acid Res, 21 (3): 775~776