全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月968
常温和低温下保存小新月菱形藻的包埋 -脱水法
薄岩, 张恩栋, 王起华 *
辽宁师范大学生命科学学院, 辽宁大连 116029
Storage of Nitzschia closterium f. minutissima by Encapsulation-dehydration
under Normal Temperature and Low Temperature
BO Yan, ZHANG En-Dong, WANG Qi-Hua*
Collage of Life Sciences, Liaoning Normal University, Dalian, Liaoning 116029, China
提要: 用包埋-脱水法在常温和低温下保存小新月菱形藻(Nitzschia closterium f. minutissima), 探讨了温度、光(暗)、含水量、
密封袋内空间体积和密封袋外膜材质等因素对保存效果的影响。结果表明, 小新月菱形藻在4 ℃下暗保存6个月后的最高
存活率达到 80.4%。而且, 保存后的藻细胞经过恢复培养后, 其生长力可达到保存前的水平。包埋 -脱水法操作简单, 无需
复杂设备, 在藻类种质保存中有广阔的应用前景。
关键词: 小新月菱形藻; 常温保存; 低温保存; 包埋 -脱水法
收稿 2008-07-07 修定 2008-09-12
资助 国家自然科学基金(30170099, 30470184)。
* 通讯作者 ( E -m a i l : q i h u a _ m a i l @ 1 6 3 . c o m ; T e l :
0 41 1-82 1 58 03 9)。
饵料硅藻在鱼、虾和贝类育苗生产中有着重
要的作用, 近年来有关饵料硅藻保存的研究日益受
到重视(朱明等 2003; 王起华等 2006)。目前微藻
保存技术主要包括: 继代保存法、干燥保存法和超
低温保存法等(Day 1999)。继代保存法是目前普
遍采用的方法, 该法简单易行, 通常在常温或常低
温下保存。但是, 其缺点是保存时间短, 需要频繁
继代, 并且容易发生污染和变异, 只能用于藻类的
短期保存(Day 1999; 潘克厚和朱葆华 2002)。干
燥保存法目前只能用于某些蓝藻和少数绿藻, 且大
多存活率很低(Day 1999)。超低温保存可能是微
藻长期保存的最好方法, 但是需要较为复杂的操作
技术和贵重的保存设备, 且只能保存微量的藻种
(Day 1999)。因此, 该法不适合藻种的中期保存, 也
无法满足大量藻类保存的需要。采用细胞固定化
技术(常用褐藻胶包埋法)保存藻种可能是藻类保存
的一条新途径, 已有研究表明, 此法可以在常低温
下实现对某些微藻的中期 ( 数月至数年 ) 保存
(Hertzberg和 Jensen 1989;马志珍和张继红 1998;
Chen 2001; Gaudin等 2006; 孟妍等 2008)。将褐藻
胶包埋技术与干燥脱水技术相结合的包埋-脱水法
虽然已经成功地用于小新月菱形藻等硅藻的超低温
保存(王起华等 2006), 但采用此法在常温和(或)低
温下保存微藻的研究目前尚鲜有报道(孟妍等
2008)。本文采用包埋 -脱水法在常温和低温下保
存小新月菱形藻, 探讨了保存温度、光(暗)、胶
球含水量、密封袋内空间体积和密封袋外膜材质
等因素对保存效果的影响, 以寻求一种适合于藻类
中期保存的新方法。
材料与方法
1 材料
小新月菱形藻(N it z s ch i a c l os t e r i u m f .
minutissima)由辽宁师范大学藻类生理实验室提
供。实验材料培养在含 100 mL f/2培养基的 250
mL三角烧瓶中, (20±2) ℃, 冷荧光, 光照强度(50±4)
µmol·m-2·s-1, 光周期L:D=14:10, 培养条件参见王起
华等(2006)。
2 包埋和脱水
2.1 包埋 将静止初期的藻细胞包埋在直径约 3.5
mm的褐藻酸钙胶球中, 包埋后的藻密度为1.0×107
细胞 /胶球。将胶球置于消毒海水中, 在(20±2) ℃
暗放置 24 h备用。包埋方法参见王起华等(2006)。
2.2 脱水及含水量的测定 取上述胶球每 120个为
一组, 分别脱水至 93.0% (未脱水对照)、 91.0%、
88.5%、81.5%和 58.8%含水量(以脱水后的胶球
鲜重为底), 脱水和含水量的计算方法参见王起华等
(2006)。
3 甘油处理
从上述各组含水量的胶球中取出部分胶球, 分
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别浸泡在含 10%甘油并与各组含水量胶球等渗的
f/2培养基中, 在与培养材料相同条件下振荡培养,
方法参见孟妍等(2008)。
4 密封和保存
4.1 密封 将上述各种处理的胶球每 5个一组分别
密封在双层农用聚乙烯透明塑料膜(膜厚度为 0.2
mm)中, 密封袋内部体积为 3 cm×1 cm×0.3 cm (长
×宽 ×高, 下同); 将部分含水量分别为 93.0%和
88.5%的胶球每5个一组分别密封在袋内部体积为
3 cm×3 cm×0.3 cm和 9 cm×3 cm×0.3 cm的上述同
样材质的袋中; 另外, 将部分含水量为 93.0%和
88.5%的胶球每5个一组分别密封在袋内部体积为
3 cm×1 cm×0.3 cm的单层聚乙烯透明塑料袋中, 在
外部另密封一层铝塑膜(铝塑膜由秦皇岛市泽宝医
药包装有限公司提供)。
4.2 保存 按照实验设置(详见实验结果部分), 将上
述密封袋分别保存在 20 ℃-黑暗、20 ℃-光照(光
照强度约 30 µmol·m-2·s-1, 其他条件同材料培养)、
4 ℃- 黑暗、4℃- 光照(自然光, 光照强度约 16
µmol·m-2·s-1)和-30 ℃-黑暗的条件下。保存时间
分别为 1 个月、3 个月和 6 个月。
5 恢复、再培养和存活率的测定
5.1 保存后的恢复和培养 将保存后的胶球放入装
有 20 mL f/2培养基的 50 mL三角瓶中, 在 20 ℃暗
处放置24 h, 在与前述材料培养相同的条件下再培
养。预实验表明, 再培养中胶球的颜色经历了逐渐
变浅之后又重新加深的变化过程, 选择在胶球颜色
变为最浅时提取叶绿素。
5.2 存活率的测定 用 100%丙酮提取胶球中藻细
胞的叶绿素并计算叶绿素 a含量, 以保存前的胶球
作为对照, 以热杀死胶球(将保存前的胶球经过 80
℃水浴加热 5 min得到)为空白。根据叶绿素 a含
量计算存活率(王起华等 2006)。
6 生长曲线和生长速率
将保存前和 4 ℃暗保存 6 个月的含水量为
88.5%的胶球移入含0.1 mol·L-1柠檬酸钠的培养基
中, 使胶球完全化解。将回收的藻细胞再悬浮于含
20 mL培养基的 50 mL三角瓶中, 置于前述藻种培
养条件下恢复培养, 以血球计数板测定藻细胞密
度。平均生长速率 K的计算公式为: K=(logNt-
logN0)/0.301t。式中, N0为接种密度, Nt为最高生
长密度, t为达到最高生长密度的培养天数。以上
参见孟妍等(2008)。
上述实验重复 3次, 每次实验同一处理设置 3
个平行样品, 文中数据为9个平行样品的平均值和
标准差。
实验结果
1 温度和保护剂甘油对存活率的影响
表1为小新月菱形藻在所设置的5种胶球含水
量和 3种保存温度下的存活率。其中, 20 ℃和 4 ℃
分别设置暗和弱光 2种保存条件; -30 ℃(暗)设置
了不加保护剂和加10%甘油作保护剂的2种条件。
未脱水的实验材料(对照, 胶球含水量 93.0%)在所
设置的 3个温度下暗中保存时, 常温(20 ℃)保存 6
个月的存活率较低, 为 25.9%; 零上低温(4 ℃)保存
6个月的存活率最高, 为 60.7%; 相比之下, 零下低
温(-30 ℃)无甘油保护剂时保存 6个月的存活率最
低, 仅为 2.3%; 而在加入 10%甘油后, 保存 6个月
的存活率提高到 34.9%。在其他含水量条件下暗
保存 6个月时, 存活率都是 4℃最高, -30 ℃(10%
甘油)次之, 而 20 ℃的存活率明显低于前二者; 同
样, 加保护剂甘油的存活率一般都远高于不加甘油
的对照。
2 含水量和光照对存活率的影响
如表1所示, 存活率都随着胶球含水量的适度
减少而增大。当含水量减少到 88.5%时, 20 ℃和
4 ℃保存 6个月的存活率都达到最高值。其中, 20
℃光和暗保存的存活率分别为25.9%和43.4%, 4 ℃
光和暗保存的存活率分别为 71.5%和 77.7%。相
同温度下暗保存的存活率都略高于光保存的存活
率。-30 ℃(添加 10%甘油)保存 6个月的存活率
在含水量减少到 81.5%时达到最高值, 为 55.1%;
而-30 ℃(不加甘油)保存6个月的存活率在同一含
水量时仅为 1.5%。
3 密封袋内空间体积对存活率的影响
表 2为密封袋内空间体积对小新月菱形藻存
活率的影响。小新月菱形藻保存 6个月的存活率
都是在密封袋内体积为 0.9 cm3时达到最高值, 并
且都随着密封袋内体积的增加而减小。当密封袋
内体积增加到 2.7 cm3时, 20 ℃(暗)保存条件下的
存活率大幅下降; 相比之下, 4 ℃(暗)保存条件下的
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存活率下降较小。
4 密封袋外膜材质对存活率的影响
表 3为密封袋外膜材质对小新月菱形藻存活
率的影响。当密封袋的外膜用铝塑膜代替聚乙烯
膜时可以明显提高存活率。如20 ℃保存6个月时,
含水量为88.5%的胶球的藻细胞存活率从43.4%提
高到 71.0%; 相同条件下 4℃保存的藻细胞存活率
从 77.7%提高到 80.4%。
5 保存前后的生长曲线和生长速率
为了进一步考察经过包埋-脱水法保存的小新
表 1 温度、光照、胶球含水量和保护剂甘油对存活率(%)的影响
温度 /℃ 光 /暗 时间 /月
胶球含水量 /%
93.0 　 91.0 　 88.5 　 81.5 　 58.8
2 0 光 1 98.4±6.7 82.8±6.1 62.9±7.2 67.9±3.7 4.0±2.8
3 73.7±9.8 77.8±8.8 65.8±8.5 50.7±8.3 3.5±1.9
6 17.4±4.1 16.0±2.9 25.9±4.5 7.1±2.8 2.9±1.3
2 0 暗 1 94.4±4.9 81.5±9.1 62.9±7.2 60.9±4.2 28.7±4.9
3 73.8±3.8 71.5±4.2 70.2±4.4 40.2±4.5 9.0±2.8
6 25.9±5.6 31.0±3.7 43.4±1.5 14.6±3.1 1.9±1.5
4 光 1 95.8±5.0 93.5±7.8 100.0±5.9 94.8±8.6 84.9±8.1
3 76.6±1.4 78.7±2.4 89.9±3.4 75.2±3.5 65.8±9.7
6 55.6±2.2 63.3±4.8 71.5±3.2 61.3±3.5 40.9±5.3
4 暗 1 96.5±6.8 97.6±9.4 100.0±4.7 100.0±5.1 95.0±5.2
3 79.3±2.6 84.6±2.9 88.6±4.7 88.3±3.0 76.1±7.7
6 60.7±4.8 67.3±3.8 77.7±1.5 69.7±2.9 46.3±2.2
-30 暗 1 2.4±1.6 2.3±1.6 2.6±1.3 4.7±1.9 7.7±3.1
3 1.4±0.7 1.2±0.5 0.9±0.5 2.2±1.6 4.4±2.2
6 2.3±1.0 1.8±0.7 1.8±0.7 1.5±0.7 3.5±1.6
-30* 暗 1 56.7±2.4 54.0±4.9 63.9±5.1 75.2±2.6 46.6±2.3
3 44.4±2.5 43.7±2.3 49.9±3.3 61.2±4.5 36.7±4.3
6 34.9±2.1 37.3±4.1 45.7±6.0 55.1±2.5 36.0±3.8
　　表中数值为存活率(%)的平均值和标准差, 下表同。密封袋由双层农用聚乙烯透明塑料膜制作, 密封袋内部体积为 0.9 cm3; *表
示添加甘油。
表 2 密封袋内体积对存活率(%)的影响

温度 /℃ 光 /暗 胶球含水量 /% 时间 /月
密封袋内体积 /cm3
0.9 2.7 8.1
2 0 暗 93.0 1 94.4±4.9 83.4±4.2 91.5±5.5
3 73.8±3.8 17.8±3.3 20.3±4.8
6 25.9±5.6 2.1±1.3 3.3±1.3
暗 88.5 1 62.9±7.2 83.6±4.6 80.7±4.2
3 70.2±4.4 21.7±4.4 21.3±3.8
6 43.4±1.0 1.8±1.0 2.2±1.3
4 暗 93.0 1 96.5±6.8 100.0±5.7 100.0±7.0
3 79.3±2.6 80.4±4.7 83.2±5.1
6 60.7±4.8 57.1±6.5 53.9±3.1
暗 88.5 1 100.0±4.7 100.0±4.2 100.0±6.1
3 88.6±4.7 80.0±2.8 82.6±5.4
6 77.7±1.5 54.0±1.7 58.4±3.9
　　密封袋由双层农用聚乙烯透明塑料膜制作。
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月菱形藻的生长力。本文分别用保存前和保存后
的藻细胞接种, 测定其生长曲线和生长速率, 结果
如图 1所示。保存前的小新月菱形藻在所设置的
培养条件下, 在9 d后达到最高生长密度, 为812×104
细胞 ·mL-1; 9 d的日平均生长速率为 0.251。相比
之下, 保存6个月的藻细胞, 经过5 d的短期恢复培
养后, 其增长速度较慢, 在 10 d后达到最高生长密
度, 为 742×104细胞 ·mL-1; 10 d的日平均生长速率
为 0.213。但是同样保存条件下的藻细胞, 在经过
2个长周期的恢复培养后, 其增长速度大大加快, 在
9 d后达到最高生长密度, 为 810×104细胞 ·mL-1; 9
d的日平均生长速率为0.250, 已经与保存前的生长
速率相近。
讨　　论
在微藻继代保存中, 为了减少接种频度, 通常
都采用比最佳培养条件较低的温度和较弱的光照强
度来抑制藻类的生长速率(Day 1999; 潘克厚和朱
葆华 2002)。当保存条件从常温(20 ℃)降低到零上
低温(4 ℃)时, 小新月菱形藻的存活率有很大的提
高。这可能是由于在 4 ℃保存能有效地降低藻细
胞的新陈代谢水平, 使存活率显著提高。这一结果
与朱明等(2003)保存中肋骨条藻浓缩液的结果相
近。然而, 在 –30 ℃无甘油保护剂时存活率极低,
这可能是细胞内结冰伤害所致; 而加入抗冻保护剂
甘油后, 存活率大幅度增加。这与孟妍等(2008)保
存绿色巴夫藻的结果相似。甘油作为渗透性抗冻
保护剂, 有利于保持细胞水分和可溶性盐类, 稳定
渗透压(李纯等 2000)。从理论上讲, 在弱光照下藻
细胞可以维持一定强度的光合速率, 有利于藻种的
保存。但是, 本文中小新月菱形藻在 4 ℃弱光条
件下保存的存活率仍然低于同温度下黑暗保存的存
活率。这可能与保存条件有关, 在本文中, 含藻细
胞的胶球是保存在不含液体培养基的密封袋中, 因
而不利于藻细胞的光合作用。孟妍等(2008)在相
同条件下保存绿色巴夫藻时曾发现, 黑暗保存的存
活率明显高于弱光照保存的存活率。目前, 对弱光
照和黑暗两种保存条件的对比研究尚鲜有报道。
表 3 密封袋外膜材质对存活率(%)的影响

温度 /℃ 光 /暗 胶球含水量 /% 时间 /月
密封袋外膜材质
农用聚乙烯膜 铝塑膜
2 0 暗 93.0 1 94.4±4.9 100.0±6.7
3 73.8±3.8 74.2±2.8
6 25.9±5.6 68.0±3.2
暗 88.5 1 62.9±7.2 98.4±9.2
3 70.2±4.4 74.4±2.8
6 43.4±1.0 71.0±2.1
4 暗 93.0 1 96.5±6.8 100.0±5.6
3 79.3±2.6 85.2±4.2
6 60.7±4.8 70.0±3.3
暗 88.5 1 100.0±4.7 100.0±6.5
3 88.6±4.7 91.6±7.0
6 77.7±1.5 80.4±3.3
　　密封袋内层由农用聚乙烯透明塑料膜制作, 密封袋内部体积为 0.9 cm3。
图 1 小新月菱形藻的生长曲线
保存前: 小新月菱形藻在包埋后(未脱水) , 经过脱固定化处
理, 再经过 5 d恢复培养后, 用于测定生长曲线; 保存后 1: 小新月
菱形藻在包埋后, 脱水至 88.5%, 4 ℃暗保存 6个月, 其他处理过
程同上, 用于测定生长曲线; 保存后 2: 包埋、脱水、保存和脱
固定化处理同保存后 1, 但经过 5 d恢复培养后, 取藻细胞接种,
再培养 8 d, 如此重复培养 2 个循环后, 用于测定生长曲线。
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采用直接干燥脱水的方法保存微藻, 目前只能用于
某些蓝藻和少数绿藻, 且大多存活率很低( Da y
1999)。本文采用褐藻胶包埋藻细胞后, 在脱水时,
可以为藻细胞提供一种缓冲和保护作用。通过适
当降低含水量, 进一步抑制了细胞的代谢强度, 大
大提高了存活率。本文结果表明, 密封袋内的空间
体积对存活率有一定影响。在暗保存中藻细胞的
呼吸作用要消耗O2并释放CO2, 密封袋内O2和CO2
的浓度改变都会影响细胞的呼吸强度。密封袋的
外膜用铝塑膜代替农用聚乙烯膜时进一步提高了密
闭性, 减少了密封袋内外的气体交换。因此, 通过
调节密封袋内的空间体积和改变外膜材质可以有效
地提高存活率。
王起华等(1999, 2006)曾先后采用两步法和包
埋-脱水法超低温保存小新月菱形藻并取得较好的
保存效果。然而, 在常温和低温下保存小新月菱形
藻的研究尚鲜有报道。本文采用包埋 -脱水法探
讨了小新月菱形藻在常温和低温下的中期保存。
结果表明, 小新月菱形藻在常温和低温下都至少可
以保存 6个月, 并保持较高的存活率。对保存后的
藻细胞的生长曲线和生长速率的测定结果表明, 保
存6个月的藻细胞经过脱固定化和一定时间的恢复
培养后, 其生长力可以达到保存前的水平。这说明
包埋-脱水法可以在常温和低温下用于小新月菱形
藻的中期保存。目前, 尚未见到采用此法于常温和
(或)低温下保存小新月菱形藻的研究报道。近年
来采用褐藻胶包埋等细胞固定化技术保存某些微藻
已证明是一条有效的途径(潘克厚和朱葆华2002)。
与超低温保存相比, 固定化保种技术操作比较简单,
不需要贵重的仪器设备; 并且可以在常低温甚至常
温下保存, 保存成本大大下降; 此外, 还可以实现大
量藻种的保存, 因此在微藻中期保存中可能有一定
的应用前景(Chen 2003)。新近, 孟妍等(2008)首
次采用包埋-脱水法在常温和低温下成功地实现了
绿色巴夫藻的中期保存。本文结果则进一步表明,
将褐藻胶包埋技术与干燥脱水技术相结合, 有可能
成为一种微藻常温和低温保种技术中的新方法。
总之, 本文将包埋 -脱水法用于小新月菱形藻
的常温和低温保存, 取得了较为理想的保存效果。
不仅保存期长达6个月, 而且可以保持较高的存活
率, 保存后的藻细胞经过适当的恢复培养后, 其生
长力可以达到保存前的水平。对更长时间的保存
效果的研究目前正在进行中。
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