全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 1期，2004 年 2 月78
测定a-淀粉酶活性的凝胶扩散法和组织印渍法
欧阳西荣*
湖南农业大学农学院, 长沙 410128
Gel Diffusion and Tissue Printing Methods for Determining a-Amylase Activity
OUYANG Xi-Rong*
College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha 410128
提要 建立了改良凝胶扩散法和组织印渍法检测α - 淀粉酶活性的方法。此法的实验条件容易控制，重复性好。组织
印渍法在玉米种子吸水约 5 h 后即可检测到α - 淀粉酶活性。
关键词 a- 淀粉酶；种子发芽；凝胶扩散法；组织印渍法
收稿 2003-01-10 修定 2003-08-25
* E-mail:oyxrong@hunau.net, Tel:0731-4618154
a- 淀粉酶（EC 2.1.1.1）的测定方法有多
种，一般是在提取酶液后，将酶提取液加入到一
定浓度的可溶性淀粉溶液中，反应一段时间后，
测定所释放的还原糖如麦芽糖含量等，以此确定
其a-淀粉酶的活性[1,2]; 或测定水解其他底物的能力
等[3]。Masojć和Larsson-Raźnikiewicz[4]报道的测
定a-淀粉酶活性的凝胶扩散法是在直径约为10 cm
的培养皿中进行的，他们所采用的凝胶厚薄、染
色、淋洗等操作均不易掌握。培养皿越大，厚
薄均匀度越难控制，而且每个培养皿测定的样品
数量极为有限，不能同时加入系列标准对照，培
养皿之间也可能会出现较大差异，因此难以用于
大批样品的分析和不同时间测定结果之间的相互比
较。Skadsen[5]报道的凝胶电泳测定a-淀粉酶活性
需要电泳槽设备，要控制电泳电压和电流，染色
脱色方法也较为复杂。我们综合了凝胶扩散法和
电泳法的优点，按凝胶电泳的方法制作凝胶，以
置于优质平板玻璃上的透明胶片作凝胶载体，并
用玻璃框架将凝胶厚度精确控制在0.5 mm，以避
免用培养皿制作凝胶时难以均匀控制厚度。另
外，将凝胶板面积增加到 300 cm2 以上，测定的
样品数大大增加。因而用扩散法测定样品时，每
块凝胶板上都可以加入a-淀粉酶系列标准液，再
根据标准曲线计算出样品 a- 淀粉酶活性。这样，
不同样品或不同时间测定的结果之间即可进行比
较。另外，此法还可将凝胶与透明胶片一起进行
染色和淋洗，操作方便，便于观察结果和直接精
确测量染色面积。本文介绍的检测酶活性的改良
凝胶扩散法和组织印渍法，用于测定玉米种子a-
淀粉酶活性的效果较好，方法简便易行，重复性
好，可用于大批量样品的分析。
材料与方法
1 试剂
a- 淀粉酶提取缓冲液：20 mmol.L-1醋酸钠(2.7216
g.L-1)、1 mmol.L-1氯化钙(0.11099 g.L-1)，pH 5.5。
5% (V/V)碘-碘化钾溶液：1.95 g KI＋0.65 g I2 溶解
在 100 mL蒸馏水中。a-淀粉酶标准液： 40 mg.
mL-1 a-淀粉酶（Sigma, ca 40 mg.mL-1猪胰腺a-淀
粉酶）母液逐级稀释为10、2.5、0.625、0.15625、
0.03906和0.009765 mg.mL-1系列标准液。20%冰乙
酸、琼脂糖、Lintner’s 淀粉均为Sigma 产品。
2 凝胶板的制作
取一块 125 mm × 260 mm 干净的优质玻璃
板，上面放 1 片与玻璃长宽相同的透明胶片
(GelBond PAG film, Pharmacia Biotech)。该胶片
一面亲水一面疏水，将疏水一面紧贴玻璃，防止
气泡产生，胶片上面长边的两侧各放置 1 条宽 5
mm、厚 0.5 mm 的塑料条，宽边不放塑料条，再
在上面盖一块同样大小的玻璃，两块玻璃两侧用
夹子固定，放入温箱中预热至 50~60℃。取一个
三角烧瓶，加入 30 mL a- 淀粉酶提取缓冲液，
再加入0.36 g 琼脂糖和 0.30 g Lintner’s 淀粉（作
为反应底物），在微波炉中加热，每隔约 5 s 摇
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动1次，煮沸直至透明后，冷却至70℃左右。将
预热的玻璃胶片框架斜放在桌面上成30°左右(不
可太斜以防凝胶漏出)，用预热（50~60℃）的
移液管吸取凝胶液，从玻璃架较高一端的空隙中
匀速注入到玻璃框架中间的胶片上面，让其流动
遍及整个胶片表面，不能有气泡产生。凝胶温度
要适宜（60~7 0℃），温度过高或过低时，凝胶
容易漏出或难以流动遍及整个胶片。注入凝胶直
到流遍胶片时即停，用量约为 25 mL。由于胶片
和玻璃对凝胶有吸附作用，可保证凝胶不漏出。
冷却后即形成附着在胶片上厚度为0.5 mm均匀的
凝胶片。贮存在 4℃低温箱中备用，贮存时间不
宜超过 7 d。
3 种子处理与发芽
玉米（Zea mays）种子以 1% Chloor-AL
（Bleek）溶液消毒 5 min，再以蒸馏水冲洗约 30
s，洗去消毒液。将种子置于带盖的塑料盘 (15
cm × 25 cm) 中的湿润滤纸之间，加20 mL 蒸馏
水，分别置于温度为25℃和10℃的恒温培养箱中
发芽。发芽过程中滤纸保持湿润。在预定的发芽
时间取样测定a-淀粉酶活性。组织印渍法所用种
子按预定发芽时间先后在不同时间开始发芽。
4 a-淀粉酶量和活性的测定
4.1 组织印渍法 取各处理不同发芽时间的种子，
用锋利刀片将种子分别以纵向（沿胚芽中部纵向
切开）和横向（沿胚芽中部）切成两半。取出
预先制作冷藏的凝胶板，揭开上面一块玻璃。每
个处理各取 5 个半粒种子置于凝胶片上，种子切
面朝下紧贴在凝胶片上。在25℃黑暗条件下培养
2 h。从凝胶片上取出种子，将凝胶片（连同下
层玻璃）浸入碘 - 碘化钾溶液中染色 5 min，加
相当于染色液体积7%的冰乙酸进行酸化，终止反
应，在蒸馏水下淋洗约 3 min，洗净染色液。然
后测量不染色区域的面积或用数码照相机摄影。
4.2 凝胶扩散法 取10粒发芽时间不同的种子
（除去幼根和胚芽鞘）,置于预先冷却的石英研钵
中，加液态氮用研槌精细研磨，研成细粉，随
即放入4℃低温箱中保存。用移液管取200 mL a-
淀粉酶提取缓冲液加入到一离心管中，加入样品
100 mg。重复 3次。在4℃恒温室内摇动培养1.5
h后，以10 000×g离心10 min，取上清液测定a-
淀粉酶活性。取出预制冷藏的凝胶板，揭开上面
一块玻璃，用塑料打孔器在凝胶板上每隔 20 mm
打一个直径2 mm的孔，用微量移液管向每孔注入
a- 淀粉酶提取液 2 mL。同时，在每块凝胶板孔
中加入 a-淀粉酶系列标准液。重复2次。以制作
标准曲线。将凝胶板置于保湿容器中，再在10℃
恒温培养箱中反应 24 h后，将凝胶板用上述方法
进行染色和淋洗。由于加入a-淀粉酶的孔周围的
淀粉被a-淀粉酶分解，因而在染色后凝胶片上出
现一个未能染色的圆，未与a-淀粉酶反应的部分
染成红色。在本方法设定的条件下，无色圆的直
径与a-淀粉酶含量或活性呈直线相关。用直径测
量仪测量该圆的直径，根据标准曲线计算出样品
a- 淀粉酶的含量或活性。
结果与讨论
1 组织印渍法
图1显示种子开始吸水后约5 h即可检测到a-
淀粉酶活性。种子发芽期间的前3 d，a-淀粉酶活
图1 组织印渍法测定玉米种子a-淀粉酶的活性
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性持续增加。酶活性开始于胚部，然后向周围组
织扩散，发芽 3 d 时遍及整粒种子。
2 凝胶扩散法
从图2 可见，凝胶板加入酶经保温后，凝胶
板染色的程度反映出不同处理a-淀粉酶活性的明
显差异。 25℃下发芽的a-淀粉酶活性显著高于
1 0 ℃发芽的（图 3 ）。
我们还用此法测定不同活力玉米种子的a-淀
粉酶活性。25℃下发芽时，不同活力种子的a-淀
粉酶活性差异很小；而在10℃下发芽时，高活力
与低活力种子的a-淀粉酶活性差异极显著（资料
略）。这可能是不同活力种子抗低温的能力差异
所 致 。
一般来说，a-淀粉酶活性开始于种子发芽的
图2 凝胶扩散法测定玉米种子a-淀粉酶活性
图3 凝胶扩散法测定玉米种子在不同温度下发芽的a-淀粉酶活性
第 2~3天[6~8]。因此人们常从第2天开始测定a-淀
粉酶活性[9]。组织印渍法的结果表明，在种子开
始吸水不久（5 h）即可检测到 a- 淀粉酶活性，
这比以往报道中的a-淀粉酶活性开始出现的时间
提早了2~3 d。由于组织印渍法不需要经过酶的提
取等操作，所以种子发芽过程中即使a-淀粉酶很
少也可检测出来。这与其它生化方法需要在a-淀
粉酶活性达到一个较高值以后才能检测到的结果不
同。我们用凝胶扩散法也没有检测到发芽第 1 天
玉米种子中的a-淀粉酶活性，第2天检测到的a-
淀粉酶活性也很低。据此我们认为，组织印渍法
可用于a-淀粉酶开始合成阶段的活性测定，也可
用于 a- 淀粉酶合成部位的定位检测。
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