全 文 ：植物生理学通讯 第 4 4 卷 第 l期 , 20 08 年 2 月
用 SO N 一PC R 快速获得长鞭红景天 CH S 基因全长及其序列分析
肖燕, 杨足君 ’ , 李光蓉 , 任正隆
电子科技大学生命科学与技术学院 , 成都 6 10 0 5 4
提要 : 采用单侧寡聚核普酸嵌套Pc R (S O N 一Pc R) 方 法 , 从长鞭红景天中扩增得到查尔酮合成酶基因(ch al co n e Syn tha se ,
CH S )
, 命名 为 尺he h s , 其序列全长为 2 4 43 b p , 包括 6 82 b p 的启动子区 、 9 57 b p 的开放阅读框和 3 ’U T R 区 。 预测序列编
码 38 1 个氨基酸 , 其氛基酸组成与其他已知的高等植物的查尔酮合成酶具有很高的同源性 , 与葡萄、 山茶花 、 杜鹃和牵牛
的同源性分别为 87 % 、 87 % 、 86 % 和 85 % 。 且大部分氨基酸序歹.J保守。 序列分析表明 , 在启动子区域也找到了 TA TA 一box 、
W
一
bo x
、
G
一
b o x lik e 等顺式作用元件 。
关键词 : 长鞭红景天 ; SO N 一PCR; 查尔酮合成酶基因(C万5 ); 基因克隆 ; 序列分析
SO N
·
PC R F a st C lo n in g a n d S eq u e n c e A n a lysis o f CH S G e n e fr o m R h o di o la
fa stig 勿ta (H o o k
.
f. e t T h o m s
.
) 5
.
H
.
F u
x IA O h
n , 狱N G z u 一Ju n * , L l G uan g 一R o n g , R E N Z h e n g 一L o n g
S c ho o lof L沙 Sc ie n e e a n d Te e hn o IO gy, Un ive rs i今 of E le c tro n ie Sc ie n e e a n d Te e hn o lo gy of Ch in a , Ch e n g du 石] 0仍4 , Ch in a
A bs tr a c t : A n e w c o m Ple te D NA se q u en e e o f c ha lc o n e sy n th a se (C月5 ) g en e , w hic h w a s sPee ia lly e x Pr e ssed in
R h o di o la s a e ha lin en s is
,
w a s clo n ed by s in g le o lig o n u e le o tid e n e ste d PC R (SON
一
PC R )
.
Th
e g e n e
, n a m e d R hc hs
,
c o n tai n ed
a le n g th o fZ科 3 bP inc lu di ng a Pro m o ter re gi o n of 68 2 bP , an O R F of 95 7 bP an d 3 , U T R are a . CH S Pr o te in
Pre d ie te d fr o m Rh
ch s sho w e d 8 7 %
,
8 7 %
,
86 %
,
85 % id e n titie s w ith CH S o f 巧tn u s v in诉ra , Ca m ellia s in e n s is ,
R ho do de
n d 尹.o n sim sii, P etu n ia x 勿b r i‘la an d re tai n ed m o st o f th e e o n se rv ed re sid u e s . S o m e Pu ta tiv e c is e leme n ts
ehar a c te ristic o f th e C H S g e n e su e h a s T 戌rA 一bo x , w- bo x
,
G
一
b o x w e re fo u n d at the Pro m o ter re g io n o f R h c hs
.
K ey w o rd s : R h o d io la fa
s tig ia ta ; S O N
一
PC R ; e ha le o n e sy n th a se (C月百): g e n e clo n e ; seq u e n e e an al ysis
红景天的主要药用化学成分为红景天普和黄酮
类等化合物 。 查尔酮合成酶(c h a le o n e sy n th a s e ,
CH S) 是类黄酮合成途径的限速酶 , 参与类黄酮的
合成 , 催化丙二酞辅酶 A 的 3 个乙酸基和对轻基
苯丙稀酞辅酶 A 的一个乙酸基的缩合 , 产生 4 , 5 ,
7
一 三轻黄烷酮查尔酮(S ti ch 等 19 92) 。 类黄酮广泛
存在于植物体内的次生代谢产物 , 在改良花色 、
防紫外辐射和保健中有一定的作用 (李军等 2 0 06) 。
它还是植物中主要花色素 , 在植物的多种功能中
起作用 。 查尔酮合成酶可在花中特异性表达 , 其
表达量的改变可能会致植物花色的变异(韩颖颖等
2 0 04)
。 采用抑制 CH S 基因的表达量来改变矮牵牛
花色的研究已比较深入 (绍莉等 1 9 96) , 但是 以药
用植物为对象来研究 C H S 的报道较少 。 鉴于此 ,
本文根据 C H S 基因的保守区设计特异引物 , 从红
景天中克隆得到保守序列 , 进而用单侧寡聚核苔
酸嵌套 p C R (sin g le o lig o n u e le o tid e n e ste d 一P e R ,
so N
一
Pc R )扩增 c H s 基因的全序列 。 以获得的红
景天 CH S 保守序列为基础 , 设计 3 条 3 , 端嵌套引
物和 3 条 5 ’端嵌套引物对两侧序列进行 SO N 一PC R
扩增 , 从而 获得全序列 。
材料与方法
长鞭红景天阴人o j io la fa s tig ia ta (H o o k · f· e t
T h o m s
.
) 5
.
H
.
Fu ]采集于四川康定县海拔 3 0 00 m
的山地 。 大肠杆菌(& c人e r ic 人ia e o li) D H 5 a 由本实
验室保存 。 红景天基因组 D N A 提取用C T A B 法(赵
为等 2 0 0 6 ) 。
根据己报道 C H S 基因的保守核普酸序列合成
收稿
资助
2 0 0 7
一
0 8
一
2 8 修定 2 0 0 7 一1 1 一 15
国家 自然科学基金(3 0 6 7 12 8 8) 和教育部新世纪优秀人才
支持计划 (N C E T 一 0 6 一 0 5 10 ) 。
通讯作者(E 一 m a il : y a n g z u ju n @ u e s t。 . e d u . c n : T e l :
0 2 8
一
8 3 2 0 6 5 5 6 )
。
植物生理学通讯 第 4 4 卷 第 1 期 , 2 0 08 年 2 月
1 对简并引物 c H sF和 c H sR , 其序列为(R =刀G ,
W = A / T
,
S = G /C
,
Y = C / T
,
K = G /T
,
H = A / C / T )
CH SF : 5
’
C CK TCH Y T G G AYG CN MG R CA R G A C
3
’: CH S R : 5
’
G G B CCR A AN C C R A A N A R M A C
-
A CC 3
, 。 通过降落式 PC R 方法对供试材料 D N A 进
行扩增 。 其扩增程序 : 94 ℃预变性 4 m in ; 其
后 94 ℃ 1 m in , 65 ℃ 1 m in , 每经过一个循环温
度降低 l oC , 7 2 aC 2 m in , 10 个循环 ; 然后 94
oC 1 m in
,
5 5 oC 1 m in
,
7 2 oC Z m in
,
35 个循
环 ; 最后 7 2 ℃延伸 10 m in 。 反应体系总体积 25
林L , 其中含 1 U T aq D N A 聚合酶(上海申能博彩
公司)、 l、p C R 缓冲液 、 1 . 5 林m o l·L 一’M g C 12 、 2 00
林m o l·L 一’d N T p 、 6 5 n g 引物和 50 一 10 0 n g 模板(长
鞭红景天 D N A )。 扩增产物经 1% 琼脂糖凝胶电泳
分离后 , 于凝胶成像系统下照相 。
根据扩增得到的保守区序列设计并合成了 3
条 5 ’端嵌套引物为 , P I : 5 ’ G A G CT T G G T G A G -
CTG G T A AT C 3
, 、
PZ : 5
’
G A G T G A T CI, 1
,
G G A ll
, -
TA G G CT G 3
’ 、
P3
:
5
’
TG G G A CTT CT A CT A CA
-
A C C A T G 3
’; 和 3 条 3 ’端嵌套引物为 , P4 : 5 ’
A G G A G A A G C T G AA A G CT A C G A G 3
’、
PS : 5
’
T A A C A T G T C G A G CG CT T G T 3
’ 、
P6
:
5
’
G A
-
G A A CA AA C T G G C TA CG T T 3
’。
PC R 扩增条件 :
50 林L 反应体系中 , dN T P 为 2 00 林m o l· L 一 ’, 引物
为 1 林m ol , 第 1 轮 Pc R 中以红景天基因组 D N A
100 n g 作为模板 , 在以后的两轮循环中 , 取上轮
扩增产物 1 林L 作为反应底物 , d N T P 为 0 . 2 5
林m o l·L 一 , , 酶为 Z u 。 so N 一Pe R 程序为在第 l 阶
段 PC R (单链延伸)中 , 9 4 oC 预变性 3 而n ; 9 4 oC
30 5
,
5 8 oC 1
.
5 Ili n
,
7 2 oC Z
,
5 m in
, 经 5 个循环
后 , 进入一个错配产生双链扩增阶段 ; 94 ℃ 3 0
s
,
2 9 oC 3 m in
, 错配 3 m in 至 72 oC ; 7 2 oC 2 . 5
m in
, 经 1 个循环后 ; 进入一个新的扩增循环阶
段 : 94 oC 10 5 , 5 5 oC 1 m in , 7 2 ℃ 2 . 5 m in ,
60 个循环(第二轮和第三轮反应为 30 个循环) , 终
延伸阶段 72 oC 7 m in 。
PC R 扩增产物经 D N A 胶回收试剂盒(上海申
能博彩公司)进行回收 。 并将回收产物连接到载体
pMD 1ST (T aK aR
a 公司) , 再将连接产物转化大肠
杆菌 D H 5 a 感受态细胞 , 后涂布于含 IP T G 、 X -
ga 卜 AmP 的 L B 固体培养基上培养过夜后进行蓝白斑筛选 。 随机挑选 巧 个的白色单菌落接种到含
A m p 的LB 液体培养基里震荡培养 。 然后提取质粒
直接 电泳 , 并用质粒 D N A 作模板用 目标引物
CH SF
、
C HS R 及通用引物M 13F 、 M 13R 进行PC R
扩增鉴定 , 筛选的阳性克隆送交上海英骏生物公
司进行测序 。 最后将克隆测序得到的核普序列送
N C B I G e n B a n k 登录 。
实验结果
1 C H S 基因的PCR 扩增
以红景天 D N A 为模板 , 用简并引物 CH S R 、
CH SF进行PC R 扩增得到一条约 so bP 条带(图l) ,
测序 结果与预期 目标 片段相符 。 登录 N C B I
G e n B a n k
, 序列号为 E F0 7 0 2 14 。
— 3 00 bP
— 8 00 bP
_ 1 00 b
P
图 1 长鞭红景天 CH S 基因的PC R 扩增
Fi g
.
l PC R Prc 心u e t o f CHS ge n e in R. fa stig ia ta
M
:
D L 3 0 0 0 分子量 ; 1 : 长鞭红景天 PC R 产物 。
2 CH S 基因 5’ 端的扩增
根据扩增片段设计引物P l 、 PZ 、 P3 进行 夕
端的扩增 , 在第 1 轮 PC R 后 , 扩增片段产生弥散
现象 , 第 2 轮 PC R 后出现了带 , 但不明显 ; 第
3 轮扩增主带十分明显 , 片段大小约 7 0 0 b p (图
2)
, 测序结果得到片段长度为 6 8 2 b p , 在 N c B I
一 1 2 0 0一 70 0 韶
一 10 0 bP
乙 J 臼
图 2 长鞭红景天 CH S 基因的 5 , 端 SO N 一PC R 扩增
Fig
.
2 SO N
一
PC R Pro du
e t o fs
, end o f
CH S g ene in R. faS 心 ia ta
M
:
D L 1 2 0 0 分子量 ; l : 第 l 轮 S O N 一 P C R 扩增产物 :
2
: 第 2 轮 S O N 一PC R 扩增产物 : 3 : 第 3 轮 SO N 一PCR 扩增产物 。
植物生理学通讯 第 4 4 卷 第 l期 , 2 00 8 年 2 月
上进行比对证实为 C H S 基因的 5 ‘端序列 。
3 CH S 基因 3 , 端的扩增
根据扩增片段设计引物 P 4 、 PS 、 P 6 进行 3 ’
端的扩增 , 经 3 轮扩增同样得到一条约 7 0 0 b p 的
片段 , 片段回收克隆后用 M 13 检测 , 结果如图
3
, 测序结果片段长 7 0 2 b p , 证实为 c H s 基 因的
3
, 端序列 。 将实验结果 1 得到的 CH S 基因的D N A
片段及其 3 ’端和 5 ‘端进行拼接 , 最终得到红景天
C H S 基因的全长 。
一1 2 00
7 00
10 0
bP
bP
2 皿
图 3 M 13 和特异引物对挑选菌落的鉴定
Fig
.
3 Id e n tifi c at io n o fPro d u e t b y M 13 an d sPe e ifl e Pri m e rs
M
:
D L 1 2 0 0 分子量 ; 1 : 特异引物扩增 ; 2 : M 13 扩增 。
4 红景夭 CH S 基因 D N A 全序列分析
将测序得到的所有片段拼接以后 , 结果如图
4 显示 , 红景天 CH S 基因(R h ehs )全长为 2 4 3 bp ,
包括开放阅读框 9 5 7 bp (53 9 一1 4 9 5 bp ) , 共编码
3 18 个氨基酸 。 在启动子区域找到了部分顺式作
用元件 。 W 一bo x 位于 8 6 和 2 50 bp 处 , TA T A 一b o x
位于 1 7 3 bp 处 , G 一bo x lik e 位于 44 9 b p 处 。 将
R he hs 与 NCB I基因库中登录的葡萄 、 山茶花等物
种的序列进行氨基酸序列比对 , 结果(图 5) 发现红
景天与其他含有此基因的各类物种同源性较高 。
本文获得的红景天序列与葡萄(Vi tn us vi n lfe ra )和山
茶花(c a m e zz ia : in 。 n : i: )的同源性最高 , 均为
8 7 %
, 与杜鹃(R h o d o d e n d : o n : im : 11) 、 牵牛
(p e tu n ia x h夕b r id a )的同源性也分别高达 56 % 、
85 %
。 据此可以推测获得的基因为 CH S 基因 。 首
稽 CH S 的晶体结构分析研究表明 , CH S 的活性位
点为 Cys ’6 4 、 p h e , ’5 、 H is , 0 , 、 A sn , , 6 (图 4 中带 *
方框标记处), 在红景天的 c H S 氨基酸序列中都己
找到 , 分别位于 R h c h s 氨基酸的第 1 2 4 、 1 7 5 、
2 6 3 和 2 9 6 位 。
图4 红景天 R hch : 基因全序列
Fi g
.
4 Fu llle n g th o f R h e hs in R. fa s tig ia ta
位于带 * 方框内的氨基酸分别为 4 个 C H S 活性位点 。
植物生理学通讯 第科 卷 第 1 期 , 20 08 年 2 月
根据图 5 比对可以看出 , 红景天 CH S 的氨基
酸序列与葡萄 、 山茶花 、 杜鹃、 牵牛的 C H S 大
部分保守 , 但却多出PSLn A R QD M v v v E v P (位
于 4 一58 处)一类氨基酸 。 这部分氨基酸的验证工
作正在进行中 。
讨 论
自1983 年第一个荷兰芹的 C月百基因序列发表
以后 , 迄今 , 已从多种双子叶 , 单子叶和裸子
植物中克隆到 CH S 基因 (廖靖军等 2 0 0 0) 。 首蓓
CH S 的晶体结构分析表明 , 其活性位点为 Cys ’64 、
Phe Z , ,
、
H is3o ,
、
A sn , , 6
。 采用根据 c 月￡基因的保
守区设计的特异引物对红景天进行降落式 PCR 扩
增 , 得到一个大小为 8 6 0 b p 的 目的片段 , 序列
分析比较表明 , 本文通过引物 CH S F 和 CH SR 扩
增得到的 C万5 基因片段 , 其起始端位于其他物位
外显子 n s’端的7 0 ~ 80 个氨基酸左右 。 并且找出
4 个活性位点 , 分别位于 Rh ch s氨基酸序列 124 位
的 Cys ’6 4 、 175 位的 Ph e Z’5 、 2 63 位的 H is , 0 3 、 29 6
位的 A sn 33 6 (图 4 )。
从 CH S 在各个物种中的序列比和聚类对分析
得知 , C厅S 基因是一个较大的基因家族 , 其编码
区比较保守(杨俊波等 2 0 0 2) , 本文获得的长鞭红
景天与已报道的所有物种的C H S 的同源性较高 。
由于 SO N 一PC R 方法是用 D N A 扩增全序列 , 并没
有去除内含子 , 所以根据红景天比其他植物多出
的氨基酸部分(即科~5 8 部分的氨基酸)序列可以推
测 : 它有可能是红景天 C H S 的内含子 , 也可能
图 5 红景天和其他植物 CH S 的氨基酸序列比较
Fl g
.
5 C o m Pari so n o n th e 姗n o a e id s e qu e n e e s o f CH S b e tw e e n R . fo s ti g ia ta a n d o th e r Plan ts
植物生理学通讯 第 4 卷 第 1 期 , 2 008 年 2 月 l 9
是 C H S 基因家族中一个尚未发现的新成员 。 目
前 , 进一步的鉴定工作正在进行中 。
有关 CH S 的研究大多是从改变花卉的颜色这
一角度出发的 , 而对其在药用价值中的研究报道
则非常少 。 近年来 , 黄酮合成的分子机制及其调
控已经成为研究的前沿和热点 , 如何在传统药学
研究方法中融入现代分子生物学技术己成为人们关
注的问题 。 本文中药用植物红景天中查尔酮合成
酶(CH S) 基因序列分析的结果 , 对以新的手段研
究各种酶在药用植物中的机制和如何保护珍贵药用
植物的资源是有一定的参考价值 。
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S tie h K
,
E id e n b e rg e r T
,
W
u r st F (1 9 9 2 )
.
E n z ym a tie e o n v e rs io n
o f d ihyd r o fl a v o v o n o ls to fl a v a n
一
3
,
4
一
d io ls u sin g fl o w er e x
-
tra e ts o f D ia n rh u s c a ry op hyll
u s L
.
(
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.
Pla n ta
,
1 8 7 :
1 0 3 ~ 1 0 8