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云南常见药用红景天的 RAPD 分析
虞 泓1, 2, 朱荣勋1, 李永谊1, 和云峰1Ξ
(11 云南英茂生物技术实验室, 云南 昆明 650106; 21 云南大学生命科学学院 生态遗传学实验室, 云南 昆明 650091)
摘 要: 目的 研究云南常见药用植物红景天的遗传背景。方法 采用RA PD 技术对 3 种 6 个居群 59 个红景天样
品进行了遗传关系研究。结果 大花红景天 3 个居群的多态位点百分率 (PPB )分别为 37197%、46115%、39145% ,
N ei’s 基因多样性 (h) 分别为 01110 3、01143 7、01137 1, Shannon’s 信息指数 ( I ) 分别为 01173 6、01222 1、01206 7,
物种水平的 PPB 为 70147% , I 为 01258 3, 基因分化系数 G st为 01263 0; 长鞭红景天 2 个居群的 PPB 分别为
43167%、44142% , I 分别为 01215 3、01217 4, 物种水平的 PPB 为 65151% , G st为 01313 2, I 为 01313 9; 云南红景天
的 PPB 为 36197% , I 为 01188 1。结论 RA PD 分子标记可很好地用于红景天物种的分子鉴定和遗传背景研究。
关键词: 大花红景天; 长鞭红景天; 云南红景天; 遗传多样性; Shannon’s 信息指数; 随机扩增多态DNA
中图分类号: R 282171013 文献标识码: A 文章编号: 0253 2670 (2005) 01 0096 04
RAPD ana lysis of comm on m ed ic ina l plan ts of R hod iola L 1 in Y unnan Prov ince
YU Hong1, 2, ZHU Rong2xun1, L I Yong2yi1, H E Yun2feng1
(11 Yunnan Inmo l L abo rato ry of B io techno logy, Kunm ing 650106, Ch ina; 21 L abo rato ry of Eco logical Genetics,
Co llege of L ife Science, Yunnan U niversity, Kunm ing 650091, Ch ina)
Abstract: Objective To analyze the hereditary background of common species from R hod iola L 1 in
Yunnan P rovince1M ethods F ifty2n ine samp les of six popu la t ion s in th ree natu ra l m edicinal species from
R hod iola L 1 w ere studied by RA PD m ethod1 Results T he percen tage of po lymo rph ic bands (PPB ) of
th ree popu la t ion s from R 1 crenu la ta w ere 37197% , 46115% , and 39145% respect ively; the N ei’s gene
diversit ies (h ) w ere 01110 3, 01143 7, and 01137 1, respect ively; the Shannon’s info rm at ion indes ( I )
w ere 01173 6, 01222 1, and 01206 7, respect ively; a t the specia l level, the PPB w as 70147% , I w as
01258 3; the genet ic d ifferen t ia t ion (G st ) w as 01263 01 T he PPB of tw o popu la t ion s from R. f astig ia ta
w ere 43167% and 44142% , I w ere 0. 215 3 and 0. 217 4, respect ively; a t the specia l level, the PPB w as
65. 51% , G st and I w ere 01313 2 and 01313 9, respect ively; the PPB of R 1 y unnanensis w as 36197% , I w as
01188 11 Conclusion RA PD mo lecu lar m arker cou ld be u sed to mo lecu lar au then t ica t ion and genet ic
d iversity analysis of m edicinal species from R hod iola L 1
Key words: R hod iola crenu la ta (Hook1 f1 et T hom s1) S1 H 1 Fu; R hod iola f astig ia ta (Hook1 f1 et
T hom s1) S1 H 1 Fu; R hod iola y unnanensis (F ranch1) S1 H 1 Fu; genet ic d iversity; Shannon’s info rm at ion
index; RA PD
红景天为景天科 (C rassu laceae) 红景天属
(R hod iola L 1) 多年生草本或亚灌木植物, 多生长在
海拔 3 000～ 5 000 m 的雪域高原及干旱、低温、缺
氧、紫外线照射强、风大、积雪的石灰岩和砾岩的恶
劣环境中[1 ]。红景天属植物在全世界有 90 多种, 分
布于欧、亚和北美的高寒山区。我国有 70 多种分布
于东北、华北、西北、西南等地, 云南有 24 种, 主要分
布于横断山区[2 ]。现代医药研究表明: 红景天具有抗
寒冷、抗缺氧、抗疲劳、抗微波辐射、抗衰老、抗肿瘤
及抗病毒、强心、增强免疫力等生理、药理作用, 并表
现出很好的双向调节作用。而且其抗疲劳、抗缺氧和
增强免疫力作用超过人参、刺五加和绞股蓝; 益智作
用超过刺五加, 又无人参兴奋过强和刺五加易致便
秘的缺点, 因此格外受到重视。
关于红景天遗传多样性及其遗传结构研究报道
十分少见, 目前缺乏开展红景天引种、驯化、繁育和
遗传育种以及栽培等工作的遗传基础资料。RA PD
是研究居群遗传多样性快速、简便、有效的方法。因
·69· 中草药 Ch inese T radit ional and H erbal D rugs 第 36 卷第 1 期 2005 年 1 月
Ξ 收稿日期: 2004203228
基金项目: 中药现代化科技产业 (云南)基地专项 (2002ZY218)
作者简介: 虞 泓 (1962—) , 教授, 博士生导师, 现从事药用植物引种驯化、遗传育种、GA P、化学和生物指纹图谱研究。
T el: (0871) 7392184 Fax: (0871) 7392576 E2m ail: fisher@yninmo l1com
此, 开展红景天居群RA PD 遗传多样性研究, 将揭
示红景天的遗传多样性及其遗传结构, 可以为红景
天的引种驯化和遗传育种提供理论依据和基础资
料。本研究试图利用RA PD 分子标记技术, 开展红
景天居群遗传多样性和遗传结构分析, 为红景天药
用植物保护、引种驯化、遗传育种、繁育栽培和 GA P
种植提供理论依据和方法措施。同时, 对红景天药
材、GA P 种植优良品种进行DNA 分子标记, 为红
景天DNA 指纹图谱奠定基础。
利用 RA PD 技术对云南常见药用红景天原植
物的 3 个种 6 个居群 59 个个体进行了随机引物扩
增, 对红景天不同种、不同居群间的亲缘关系和遗传
多样性进行了探讨, 为红景天引种驯化和繁育栽培,
GA P 规范化种植和分子指纹鉴定提供素材和依据。
1 材料和方法
111 实验材料: 供试的 3 个种 6 个居群 59 个个体
分别采自云南省中甸、丽江、怒江, 并引种驯化种植
在香格里拉县小中甸镇共卓社引种驯化基地 (海拔
3 300 m ) , 样品来源见表 1。
表 1 供试样品材料
Table 1 Plan t mater ia ls for test
种 名 产 地 居群 数量 编 号 海拔öm
大花红景天 中甸哈巴雪山 HA 10 HA 12HA 25 3 500
丽江玉龙雪山 HB 10 HB22HB20 3 500
怒江高黎贡山 HC 9 HC12HC9 3 500
长鞭红景天 中甸格咱红山 HD 10 HH 12HH 10 4 200
中甸朗都雪山 HH 10 HD 12HD 13 4 100
云南红景天 怒江高黎贡山 H G 10 H G12H G15 3 100
112 实验方法
11211 红景天基因组总 DNA 的提取: 基因组
DNA 提取采用 CTAB 法[3 ] , 并稍作修改。015 g 左
右的植物组织加入到 4 mL 预热到 65 ℃的 2×
CTAB (含 2% Β2巯基乙醇)中, 研磨成糊状, 65 ℃水
浴 1 h, 冷却至室温, 加入 1ö3 体积 5 mo löL 的 KA c
冰浴 1 h, 4 ℃ 7 000×g 离心 3 m in, 取上清液, C I
抽提液 (氯仿2异戊醇= 24∶1) 抽提 2 次, 取上清液
加 3ö4 体积的异丙醇, - 20 ℃静置 30～ 60 m in,
12 000×g 离心 10 m in, 70% 乙醇洗 2 次, 无水乙醇
洗 1 次。加 400 ΛL 1×T E, 室温静置 2 h, 使DNA 充
分溶解, 1% 琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色, 用ΚDNA (20、50、100 ngöΛL ) 标定, 利用 Kodak 1D 分
析软件分析并标定到 20 ngöΛL 备用。
11212 RA PD 扩增: 引物筛选: 从 80 个随机寡核苷
酸引物 (上海生工)中筛选出 21 个扩增良好、带型清
晰的引物用于正式扩增。见表 2。
表 2 引物扩增结果
Table 2 Pr imers for ampl if ica tion
引 物 序 列 引 物 序 列
S1 GT T TCGCTCC S217 CCAA CGTCGT
S5 T GCGCCCT TC S366 CA CCT T TCCC
S8 GTCCA CA CGG S399 GA GT GGT GA C
S12 CCT T GA CGCA S461 GTA GCA CTCC
S21 CA GGCCCT TC S462 TCGGCA CGCA
S35 T TCCGAA CCC S463 CT GA TA CGCC
S82 GGCA CT GA GG S464 GT GTCTCA GG
S94 GGA T GA GA CC S465 CCCCGGTAA C
S201 GGGCCA CTCA S466 GT GGGCT GA C
S208 AA CGGXGA CA S512 A CA GGT GCGT
S212 GGGT GT GTA G
反应体系: 采用 25 ΛL 反应体系, 其中模板
DNA 40 ng, 20 mmo löL M gC l2 (T aq 酶配套) , 215ΛL 10 ×Buffer ( T aq 酶 配 套 ) , dN T P s 为 012
mmo löL (上海生工) , T aq 酶 (Shanghai P rom ega)
210 U , 引物 (上海生工) 2164 ngöΛL。
扩增程序: 反应在 PE9700 型 PCR 仪 (美国应
用生物系统公司)进行, 采用降落式多聚酶链式反应
(Touch2dow n PCR ) 程序, 循环参数为 94 ℃预变性
5 m in, 然后经 94 ℃变性 30 s, 40 ℃梯度降温退火 30
s (每个循环降温 1 ℃) , 72 ℃延伸 60 s, 循环 14 次
后, 将退火温度恒定在 34 ℃再循环 26 次, 最后 72
℃延伸 7 m in, 灭菌水代替模板DNA 作空白对照。
产物检测: 扩增产物在 1×TA E、210% 的琼脂
糖凝胶中电泳, 溴化乙锭染色, 用 GeneR u lerTM 100
bp DNA L adder 作分子量标记 (M B I Ferm en tas) ,
Kodak 1D 凝胶成像系统照相, 曝光 2 m in。
11213 数据统计分析: 利用 Kodak 1D 分析软件分
析, 每个样品的扩增带按有或无记录,“有”赋值为
1,“无”赋值 0, 得到原始数据矩阵。弱带及重复性不
好的条带不予统计。利用 PAU P 3 Beta 10 fo r Pow er
PC 商用软件包和 PopGene 32 共享软件计算统计
所得数据。
2 RAPD 扩增结果
本实验中 21 个随机寡核苷酸引物所检测到的
片段大小在 0124～ 212 kb, 条带清晰可辨, 部分结
果见图 1。PAU P 软件运算得到红景天 59 个个体间
的非加权算术平均数 (U PGM A ) 聚类树, 用靴带值
(500 次重复抽样) 检验各分支的支持强度, 见图 2。
利用 PopGene 32 软件, 假定H ardy2W einberg 平衡
得到红景天居群的遗传距离, 物种和居群水平的平
均等位基因数 (A )、有效等位基因数 (A e)、N ei’s 基
因多样性 (h )、Shannon’s 信息指数 ( I ) 和多态位点
比率 (PPB ) , 见表 3; 红景天居群基因分化系数
·79·中草药 Ch inese T radit ional and H erbal D rugs 第 36 卷第 1 期 2005 年 1 月
图 1 引物 S21 对红景天不同个体的扩增
结果 (图上的数据为个体编号)
F ig11 RAPD ampl if ied products generated by S21
to d ifferen t samples of Rhod iola L 1
(data in f igure are No1 of samples)
图 2 红景天 59 个样品 UPGM A 系统树 (基于靴带检
验, 分支上的数字是 500 次检测的靴带值)
F ig12 D endrogram of 59 samples of Rhod iola L 1
by UPGM A (based on bootstrap, numbers
on branches are bootstrap estimates
for 500 repl icates)
(G st) , 见表 4。
3 结果分析与讨论
311 红景天居群的遗传变异: RA PD 分子标记中,
PPB 值的大小代表了居群遗传多样性水平的高低。
祖元刚等用等位酶分析技术对分布于黑龙江大海林
林业局高山红景天 R 1 sacha linensis A 1 Bo r1 天然
分布区内 3 个亚居群及吉林长白山 1 个亚居群的 9
种酶系统 18 个位点进行了遗传分析, 结果表明居群
内 存在一定的遗传变异 ( PPB = 30155% , A =
11333) [4 ]。颜廷芬等用等位酶分析技术对分布于黑
龙江大海林林业局平顶山及吉林长白山北坡的 4 个
海拔梯度的长白红景天 R 1 ang usta N akai 的遗传
多样性及遗传分化进行了初步分析, 结果表明长白
红景天天然居群中存在一定的遗传变异 (A = 1148,
PPB = 4617% , H e= 01195) [5 ]。在本研究中大花红
景天居群和长鞭红景天居群水平的PPB 平均分别
表 3 居群内部和居群间的平均等位基因数、有效等位基因
数、Ne i 氏基因多样性、Shannon’s 指数、Shannon 多样
性基因遗传分化系数及多态位点比率
Table 3 Average number of a lleles, effective a lleles,
Ne i′s gene diversity, Shannon’s information
index of d iversity, gene differen tia tion by
Shannon diversity, and PPB with in and
among population s from Rhod iola L 1
品 种 居群 A A e h I I st PPBö%
大花红景天 HA 11379 7 11172 2 01110 3 01173 6 37197
HB 11461 5 11232 4 01143 7 01222 1 46115
HC 11394 5 11230 6 01137 1 01206 7 39145
居群均数 11411 9 11211 7 01130 4 01200 8 01222 6 41119
物种数 11704 7 11254 1 01161 4 01258 3 70147
长鞭红景天 HH 11444 2 11231 1 01141 5 01217 4 44142
HD 11436 7 11227 6 01140 1 01215 3 43167
居群均数 11440 5 11229 4 01140 8 01216 4 01310 8 44105
物种数 11655 1 11347 5 01206 8 01313 9 65151
云南红景天 HG 11369 7 11205 4 01123 8 01188 1 36197
A 2等位基因数 A e2有效等位基因数 h2N ei’s 基因多样性 I2
Shannon’s 信息指数 I st2Shannon 多样性基因遗传分化系数
PPB2多态位点比率
A 2allele num ber A e2effective allele num ber h2N ei’s gene
diversity I2Shannon’s info rm ation index I st2gene differen tiation
by Shannon diversity PPB2percen tage of po lymo rph ic bands
表 4 云南长鞭红景天和大花红景天居群遗传分化分析
Table 4 Population genetic d ifferen tia tion G st
analysis of R 1 f as tig ia ta and R 1
crenu la ta from Y unnan Prov ince
种 H t H s D st G st
长鞭红景天 (HH + HD ) 01206 8 01142 1 01064 7 01313 2
大花红景天 (HA + HB+ HC) 01162 4 01119 7 01042 7 01263 0
G st2基因遗传分化系数 H t2总基因遗传多样性 H s2种群基因
遗传多样性 D st2居群间基因多样性
G st2coefficien t of gene differen tiation H t2to tal gene diversity
H s2gene diversity w ith in popu lation D st2gene diversity among
popu lations
为 70147% 和 65151% (表 3) , 均显著高于高山红景
天和分布范围狭窄的长白红景天, 这与大花红景天
和长鞭红景天所具有的丰富的蕴藏量和广泛分布的
状态一致。
从物种水平看, 大花红景天 PPB 值 (70147% )
大于长鞭红景天 PPB 值 (65151% ) ; 从居群水平看,
大花红景天居群平均 PPB 值 (41119% ) 小于长鞭红
景天居群平均 PPB 值 (44105% ) , 云南红景天居群
PPB 值最小 (36197% )。从物种水平看, N ei’s 基因
多 样性, 长鞭红景天 ( 01206 8) > 大花红景天
(01161 4) ; Shannon’s 信 息 指 数, 长 鞭 红 景 天
(01313 9) > 大花红景天(01258 3)。从居群平均水平
看, N ei’s 基因多样性也是长鞭红景天 (01140 8) > 大
·89· 中草药 Ch inese T radit ional and H erbal D rugs 第 36 卷第 1 期 2005 年 1 月
花红景天 (01130 4) ; Shannon’s 信息指数也是长鞭
红景天 (01216 4) > 大花红景天 (01200 8)。由此可
见, 除了物种水平的 PPB 值以外, 长鞭红景天遗传
多样性总体大于大花红景天。大花红景天 PPB 值大
于长鞭红景天可能是由于长鞭红景天检测居群数少
于大花红景天检测的居群数。
312 红景天居群的遗传多样性及基因型的聚类分
析: 从 RA PD 分子标记聚类树上可以看出, 不同种
的红景天属植物得到了明确的区分, 每种红景天不
同居群的不同个体均在种一级聚在一起, 表明
RA PD 分子标记可以作为其种的分子鉴定依据。在
居群水平上, 同为中甸出产的 2 个长鞭红景天居群
从遗传距离和遗传一致度上得到了良好的分辨, 大
花红景天的怒江高黎贡山居群也与另 2 个大花红景
天居群明显分开 (图 2, 表 5) , 表明RA PD 分子标记
对同种红景天不同居群有较好的鉴别力。大花红景
天中甸哈巴雪山和丽江玉龙雪山居群遗传相似性最
大, 因为 2 个居群分布较近, 仅为金沙江一江之隔,
它们的遗传距离较小为 01032 5, 遗传一致度较大为
01968 0 (表 5) ; 两个居群存在较强烈的基因流动, 其
基因流N m 值为 31309 2, 远大于大花红景天的平
均值N m = 11401 4。
表 5 红景天 6 个居群的 Ne i氏遗传距离 (斜下)及遗传特性
Table 5 N ie’s genetic d istance (below diagonal)
and genetic iden tity in six population s
of Rhod iola L 1
居群 HA HB HC HH HD H G
HA 3 3 3 3 01968 0 01910 1 01829 6 01825 9 01805 4
HB 01032 5 3 3 3 3 01921 5 01827 0 01815 1 01811 0
HC 01094 2 01081 8 3 3 3 3 01799 5 01797 2 01784 2
HH 01186 9 01190 0 01223 8 3 3 3 3 01856 4 01794 9
HD 01191 2 01204 4 01226 7 01155 0 3 3 3 3 01799 8
H G 01216 4 01209 5 01243 1 01229 5 01223 4 3 3 3 3
将红景天不同种特有带和居群特有带进行克隆
测序, 转化为 SCA R 标记, 则可对红景天属药用植
物进行种或居群的DNA 分子鉴定, 并在一定程度
上区分其地道性。
313 红景天居群的遗传分化: N ei (1973) 把总基因
多样性 (H t) 分解为居群内基因多样性 (H s) 和居群
间基因多样性 (D st) , 即: H t = H s+ D st, 而 G st = D stö
H t, 所以, 居群的基因分化系数 G st = (H t - H s) ö
H t。由表 5 可知, 大花红景天 3 个居群的基因分化
系数G st为 01263 0, 即在总的遗传变异中有 2613%
的变异存在于居群间, 7317% 的变异存在于各居群
内; 长鞭红景天 2 个居群的G st为 01313 2, 即在总的
遗传变异中有 31132% 的变异存在于居群间,
68168% 的变异存在于各居群内。根据 Shannon′s 信
息指数、Shannon 多样性基因遗传分化系数 I st =
(H sp - Hpop ) öH sp , 大花红景天 I st= 01222 6, 长鞭
红景天 I st= 01310 8, 与两者的G st值基本一致。研究
显示, 长鞭红景天居群间的遗传分化程度高于大花
红景天。
H am rick 等 (1990)认为影响居群遗传变异大小
的主要因素依次为: 繁育系统、分布范围和生活型,
红景天繁育系统均以异花授粉为主, 有性生殖兼无
性生殖。所以, 影响居群遗传变异的主要因素是分布
范围、地理位置及小生境的差异[6 ]。调查表明, 大花
红景天一般生长于雪线附近的流石滩上, 分布于海
拔 3 800～ 5 500 m 的地方; 长鞭红景天从海拔
2 500～ 5 400 m 内均有分布, 适应幅度也较大。所
以, 长鞭红景天 (G st= 01313 2)的遗传分化程度大于
大花红景天 (G st= 01263 0) , 而两者的 G st值又均大
于分布范围狭窄的长白红景天 (G st= 01134)。
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