全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月 847
水稻NADP-苹果酸酶的原核表达、纯化和抗体制备
程玉祥 *，柳参奎
东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心，哈尔滨 150040
提要：构建了水稻 NADP-ME2基因 cDNA的原核表达载体 pQE30，并诱导表达出有生物学功能的融合蛋白。用Ni-NTA
琼脂糖亲和层析纯化出NADP-ME2融合蛋白，并测定了融合蛋白酶学特性(Vmax、Km、Kcat、底物特异性)。用纯化的NADP-
ME2融合蛋白免疫家兔，制备出抗水稻NADP-ME特异性抗体。全蛋白双向电泳后Western印迹表明水稻中至少有 4个
NADP-ME家族蛋白质成员。
关键词：水稻；NADP-ME2；原核表达；酶学特性；抗体
Prokaryotic Expression, Purification and Antibody Production of Rice (Oryza
sativa L.) NADP-Malic Enzyme
CHENG Yu-Xiang*, LIU Shen-Kui
Alkali Soil Natural Environmental Science Center, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: Rice NADP-ME2 cDNA was constructed into prokaryotic expression vector (pQE30), and its bio-
logically active fusion protein was expressed. NADP-ME2 fusion protein was purified by Ni-NTA agarose
affinity chromatography, and its enzyme properties such as Vmax, Km, Kcat, and substrate specificity were
detected. Purified NADP-ME2 fusion protein was used to immunolize rabbit. Anti-rice NADP-ME specific
antibody was obtained. Four members of NADP-ME family protein had been detected by Western blot from
rice total proteins after two-dimensional gel electrophoresis.
Key words: rice (Oryza sativa); NADP-ME2; prokaryotic expression; enzyme property; antibody
收稿 2007-06-26 修定 2007-08-28
资助 国家高科技研究发展计划(2002AA241111)和东北林业
大学校立科研基金。
* E -m a i l：c he n g yu x ia n g1 1 1 @s i na . co m . cn；T el：
0451-82191402
苹果酸酶(malic enzyme，ME)是生物体内苹
果酸代谢中的关键酶之一。在二价金属离子存在
下，ME催化苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸、CO2
和NAD(P)H (Chang和 Tong 2003)。根据结合辅
酶因子的不同，ME分为 NAD-苹果酸酶(NAD-
ME，EC1.1.1.39)和NADP-苹果酸酶(NADP-ME，
EC1.1.1.40)。编码NADP-ME的是多基因家族，
Wheeler 等(2005)认为拟南芥基因组中有 4 个
NADP-ME基因。植物体内NADP-ME参与不同代
谢途径(Drincovich等 2001)，根据行使功能的不
同将NADP-ME分为光合型与非光合型。位于 C4
植物维管束鞘细胞叶绿体(bundle sheath chloroplast)
中的NADP-ME催化苹果酸氧化脱羧，生成的CO2
用于 Rubisco酶的光合碳固定(Rothemel和Nelson
1989；Edwards和 Andreo 1992)，景天酸代谢
(crassulacean acid metabolism，CAM)的植物细胞
质中NADP-ME也参与光合作用(Honda等 2000)。
最近的一些研究报道，C3植物NADP-ME与植物
防御反应或逆境响应(plant defense reactions/stress
responses)相关(Pinto等 1999；Casati等 1999b)。
但NADP-ME参与植物防御反应或逆境响应的具体
机制还不清楚。
C3植物水稻NADP-ME也是多基因编码的。
1994年 Fushimi等分离出水稻质体型 NADP-ME。
最近，我们分离了盐碱逆境下的水稻 N A D P -
ME2，过量表达 NADP-ME2的拟南芥，其抗盐和
耐渗透胁迫能力明显提高(Liu等 2007)。另外，过
量表达水稻细胞质NADP-ME的拟南芥抗盐性也明
显增强(Cheng和 Long 2007)。Chi等(2004)的研究
表明，水稻 NADP-ME家族基因各自的mRNA表
达模式存在明显差异。本文中我们将水稻的
NADP-ME2 (GenBank accession No. AB053295) cDNA
片段插入到 pQE30载体，并在M15大肠杆菌中进
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行了表达，同时对其进行了纯化，得到 NADP-
ME2融合蛋白；随后分析了所纯化融合蛋白的酶
学特性并制备出特异性的NADP-ME多克隆抗体。
用此种NADP-ME抗体进行分析的结果表明水稻中
至少有 4个NADP-ME蛋白质成员。现报道如下。
材料与方法
构建水稻 NADP-ME2原核表达载体的引物
(P1、P2)为 5-GGTACCATGGAGAGCACCAT-
GAAGGG-3和 5-CTGCAGTCACCGGTAGT-
TGCGGTAAA-3，以本实验室保存的已插入了水
稻 NADP-ME2全长 cDNA重组质粒 pMD18-T-
NADP-ME2为模板，PCR扩增出目的片段，并插
入到表达载体 pQE30 (QIAGEN公司)。经DNA测
序得到重组质粒 pQE30-NADP-ME2，重组质粒
DNA转化M15菌株(QIAGEN公司)。挑取阳性克
隆，用于融合 NADP-ME2原核表达和纯化。
阳性克隆于 LB培养基 37 ℃过夜培养，次日
按 1:100比例接种到新鲜LB培养基中，继续培养
至OD600值约为 0.6，加诱导物异丙基硫代半乳糖
苷(IPTG)终浓度至 1 mmol·L-1，诱导表达NADP-
ME2融合蛋白。为获得NADP-ME2融合蛋白的最
佳可溶性表达条件，实验进行了不同培养温度
(20~37 ℃)、IPTG浓度(0.01~1 mmol·L-1)及诱导
时间(3~16 h)的优化。
融合蛋白纯化过程为：用 1.5 L细菌培养物
离心后收集的菌体重悬于溶液 A (50 mmol·L- 1
NaH2PO4，300 mmol·L-1 NaCl，15 mmol·L-1咪唑，
0.5% Triton X-100，1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟，pH
8.0)中，加入溶菌酶终浓度至 1 mmol·L-1，混匀、
冰置 45 min后于 4 ℃下以 35 000×g离心 30 min，
取出的上清液粗蛋白用Ni-NTA琼脂糖层析柱(1.5
cm×5 cm)分离，得到的融合蛋白以Ni-NTA琼脂
糖亲和；加 100 mL溶液 B (30 mmol·L-1咪唑，其
余成分与溶液A相同)冲洗层析柱、去除杂蛋白；
用 1.5 mL溶液 C (50 mmol·L-1 NaH2PO4，300
mmol·L-1 NaCl，300 mmol·L-1咪唑，pH 8.0)竞争
洗脱融合蛋白。融合蛋白于 4 ℃下以溶液D (10
mmol·L-1 NaH2PO4，100 mmol·L-1 NaCl，1 mmol·L-1
苯甲基磺酰氟，pH 8.0)透析 16 h。收集纯化的融
合蛋白，用于 SDS-PAGE、酶学特性分析及抗体
制备。
蛋白质含量测定参照Bradford (1976)的方法。
NADP-ME酶活测定参照Cheng等(2006)的方
法。
NADP-ME抗体制备和检测效价时，以纯化
的水稻融合蛋白NADP-ME2作为抗原，与1 mL弗
氏完全佐剂混匀，按常规程序免疫家兔，共免疫
4次。取血，于 4 ℃下析出血清，分离出的血清
加入 0.02%叠氮钠，进行 ELISA效价检测。
提取植物总蛋白和水稻全蛋白双向电泳时，
水稻种子于温室中正常发芽、生长至 14 d，幼苗
总蛋白质的提取及其双向电泳方法参照 Yan等
(2 005 )文中的方法。另外，取水稻、小麦、玉
米、高粱和芦荟(Aloe vera L.)幼苗组织 1 g液氮
研磨、加入提取缓冲液(75 mmol·L-1 Tris-HCl，pH
7.5；0.1% Triton X-100；1 mmol·L-1 EDTA；1
mmol·L-1 DTT；1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟)悬浮，
于 4 ℃下以 13 000×g离心 15 min，得到的上清液
直接用于 SDS-PAGE。
Western印迹分析时，将 SDS-胶中蛋白电转
移至硝酸纤维膜(NC)上，膜用含3%脱脂奶粉TBS
封闭 2 h，用 TBS (含 0.05% Tween-20)洗膜 4次，
每次 5 min。以 1:5 000比例加入一抗，于 30 ℃
下轻摇 1 h，用 TBS (含 0.05% Tween-20)洗膜 4
次，每次 5 min。以 1:2 000比例加入二抗(碱性
磷酸酶标记羊抗兔)，30 ℃下轻摇 1 h，用含 0.05%
Tween-20的TBS洗膜 4次，每次 5 min，加BCIP/
NBT显色。
结果与讨论
1 水稻NADP-ME2融合表达质粒的构建
PCR扩增的水稻NADP-ME2开放阅读框(open
read frame，ORF) cDNA片段，其长度约为 1.8
kb (图 1)，与预期片段长度相符。双酶切后装入
pQE30载体，DNA测序表明融合的NADP-ME2开
放阅读框序列完全正确。重组表达质粒 pQE30-
NADP-ME2转化入M15菌株，挑取阳性克隆用于
NADP-ME2融合蛋白表达与纯化。
2 水稻NADP-ME2融合蛋白表达与纯化
37 ℃下 IPTG终浓度为 1 mmol·L-1诱导 1 h和
3 h后，以 SDS-PAGE分析的结果表明：M15高
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水平地表达了分子量约为 62 kDa的融合蛋白(图
2)，与预期的 6×His-NADP-ME2融合蛋白分子量
一致。但在此种条件下纯化得到的融合蛋白大部
分以不溶性方式存在。因此，又分别作了不同温
度(20~37 ℃)、IPTG诱导物浓度(0.01~1 mmol·L-1)
和诱导时间(3~16 h)的实验，确定优化的融合蛋白
诱导表达条件为：28 ℃、0.15 mmol·L-1 IPTG
及 6 h的诱导时间(资料未列出)。在此种优化的诱
导表达条件下，诱导融合蛋白大量表达，并以亲
和层析法对6×His-NADP-ME2融合蛋白进行纯化。
SDS-PAGE表明纯化的融合蛋白纯度达到电泳纯
(图 2 )。
3 水稻NADP-ME2融合蛋白的酶学特性
对纯化的NADP-ME2融合蛋白进行了其酶学
特性分析测定。酶活性检测的结果表明，融合蛋
白NADP-ME2具有较高的NADP-ME特异活性。
NADP-ME2融合蛋白的最适pH值约为7.3 (资料未
列出)。体外 20~35 ℃下NADP-ME2融合蛋白的酶
活性能够保持稳定 7 h以上，并且酶活性差别不
显著，4 ℃下其酶活性在一周内下降不明显(资料
未列出)。进一步分析NADP-ME2融合蛋白的酶促
动力学常数显示，NADP -ME 酶促反应为双底
物：L-苹果酸和NADP，改变其中一个底物的浓
度测定 Km、Vmax，其他底物和辅助因子浓度处于
饱和状态，测定单位时间内生成NADPH量的结果
表明，L - 苹果酸底物浓度变化范围为 0 . 0 1 ~ 5
mmol ·L-1，NADP 底物浓度变化范围为 1~400
µmol·L-1。NADP-ME2融合蛋白的酶促动力学常数
Km、Vmax、Kcat及 Kcat/Km数值见表 1。另外，实
验还表明Mg2+是NADP-ME2融合蛋白保持酶活性
的辅助因子；NAD代替 NADP用作底物时，未
检测到NADP-ME2融合蛋白酶活性(表1)，这也表
明它是NADP-ME型。
不同光合类型的 C4植物玉米(Drincovich等
1991)和盐木属植物(Haloxylon persicum) (Casati等
1999a)、C3植物小麦(Casati等 1997)、CAM植物
冰花(Mesembryanthemum crystallinum) (Saitou等
1992)和露草(Aptenia cordifolia) (Ferreyra等 2003)
中，NADP-ME的分离纯化已有所报道。从 C4、
CAM及C3不同光合类型植物中纯化的NADP-ME
图 1 水稻NADP-ME2开放阅读框 cDNA的扩增
Fig.1 Amplification of rice NADP-ME2 cDNA
ORF fragment
M：DNA maker (HindIII 酶切 λDNA); 1：PCR 产物。
图 2 水稻NADP-ME2融合蛋白的表达和纯化
Fig.2 Expression and purification of rice NADP-ME2
fusion protein
　　1：未诱导重组菌体总蛋白；2：诱导 1 h 重组菌体总蛋
白；3：诱导 3 h 重组菌体总蛋白；4：纯化的 H i s - N A D P -
M E 2；M：标准蛋白的分子量。
表 1 水稻NADP-ME2融合蛋白的酶促动力学特性
Table 1 Enzymatic kinetic property of rice NADP-ME2 fusion protein
Vmax/µmol·min-1·nmol-1 Km/µmol·L-1 Kcat/s-1 Kcat/Km/mol-1·L·s-1 底物特异性
　苹果酸 NADP 　　苹果酸 NADP 苹果酸 NADP 苹果酸 　 NADP Mg2+ 　 NAD
5.7 5.5 2 300 8 5 95.0 91.7 4.1×104 1.1×106 是 不是
　　表中数值是在 pH 7.3 (最适 pH)下测定的。
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酶活性、最适 pH、酶动力学常数(Km、Vmax、Kcat)
有明显差别(Drincovich等2001)。但水稻的NADP-
ME蛋白质特性尚未见报道。我们在原核生物大
肠杆菌中表达并纯化了水稻 NADP-ME2融合蛋
白，酶促动力学特性分析表明，水稻的 NADP-
ME2特性与C3植物的细胞质型NADP-ME类似，但
与 C4植物及 CAM植物的NADP-ME不同。
4 抗体的制备和特异性分析
家兔以NADP-ME2融合蛋白4次免疫后采血，
制备抗血清。ELISA检测的结果表明，免疫前的
血清基本上没有抗血清效价，而融合蛋白免疫后
的抗血清效价高达 1:12 500 (图 3)。
为检验所制备的水稻NADP-ME2融合蛋白抗
体的特异性，将以 10% SDS-PAGE分离的水稻、
小麦、玉米、高梁和芦荟的总蛋白转移至 NC膜
上，并与抗体探针杂交。免疫前的血清在保温后
不出现特异性条带(资料未列出)，而以抗血清保
温的则出现多条特异性条带(图 4)，这表明制备的
抗 N AD P - M E 2 多克隆抗体是特异性的。水稻
NADP-ME抗体的获得对进一步研究水稻NADP-
ME家族蛋白各成员个体功能及其之间功能差异可
能很有帮助。另外，用NADP-ME2抗体杂交后水
稻出现 3条特异性带(图 4)，这一结果表明水稻的
NADP-ME是个家族蛋白，至少有 3个成员。
5 水稻NADP-ME家族中蛋白质成员的鉴定
为了精确地了解水稻中NADP-ME家族蛋白
质的数目，我们将提取的水稻的全蛋白、进行了
双向电泳分离(图 5)。双向电泳分离后的水稻全蛋
白转移到NC膜上，用抗水稻NADP-ME2融合蛋
白的多克隆抗体进行Western印迹分析的结果(图
6)表明，水稻中至少有 4个不同NADP-ME蛋白
质，他们的分子量分别约为 62、62、56 和 4 8
kDa，等电点分别约为 6.7、6.3、5.8和 5.5。这
些结果表明水稻中至少有 4个NADP-ME家族成
员，这一结果尚未见报道。
图 3 水稻NADP-ME2融合蛋白抗血清的 ELISA检测
Fig.3 ELISA analysis of rice NADP-ME2
fusion protein antiserum
0 1、0 2 为两个平行的家兔，采血分为免疫前及免疫后。
图 4 水稻NADP-ME2融合蛋白抗血清Western检测
Fig.4 Western analysis of rice NADP-ME2
fusion protein antiserum
每泳道蛋白上样量为 30 µg。
图 5 水稻全蛋白的双向电泳
Fig.5 Two-dimensional gel electrophoresis of
rice total proteins
M：标准蛋白的分子量。
Tauata等(2002)用抗玉米62 kDa的NADP-ME
抗体免疫杂交，在玉米不同的组织和器官中也曾
检测到了3个不同NADP-ME蛋白。就已有报道的
NADP-ME蛋白质而言，不同植物的NADP-ME家
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族成员个体其分子量(在 SDS-PAGE胶上)是不同
的，大小有从 62 kDa到 72 kDa (62 kDa、64或
65或 67 kDa、72 kDa)不等，分子量小于 62 kDa
的NADP-ME个体尚未发现过。但我们用抗水稻
NADP-ME2多克隆抗体Western印迹的结果揭示，
水稻中NADP-ME家族成员中有2个个体的分子量
小于 62 kDa，分别约为 56 kDa和 48 kDa。
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