全 文 ：植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月 145
光敏核不育水稻‘农垦 58S’精细胞的分离
赵玉辉， 田惠桥*
厦门大学生命科学学院，福建厦门361005
Isolation of Sperm Cells from Photoperiod-sensitive Genic Male-Sterile Mu-
tant of Rice (Oryza sativa L. ssp. Japonica)
ZHAO Yu-Hui, TIAN Hui-Qiao*
School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen, Fujian 361005, China
提要：文章对常用的渗透压冲击法作了改进，并从水稻成熟花粉粒中分离出大量精细胞。显微镜下的2个精细胞具有二
型性，用显微操作仪从中分别挑选出2个细胞群体，并以荧光素二醋酸酯(FDA)染色的结果表明，分离的精细胞是活的。
关键词：精细胞；分离；光敏核不育水稻
收稿 2006-09-11 修定 　2007-01-04
*通讯作者(E-mail：hqtian@jingxian.xmu.edn.cn；
Tel：0592-2186486)。
精细胞作为雄配子在被子植物的双受精过程
中有重要地位，分离精细胞是进行精子二型性和
生理生化研究的基础，也是研究高等植物精、卵
识别过程中生理生化和分子生物学的前提。水稻
是具三胞花粉的植物，精细胞的分离可直接从花
粉粒爆破出来。水稻花粉精细胞的分离已有陆续
报道(苟小平等1998，1999，2001；Khalequzzaman
和 Haq 2005)，但资料仍较少。‘农垦 58S’是
我国发现的一种对光周期敏感的雄性不育水稻，
本文报道其精细胞分离的结果。
材料与方法
材料为光敏核不育水稻(Oryza sativa L. ssp.
Japonica)品种‘农垦 58S’。
对渗透压冲击法(苟小平等1998；Russell
1986)作了一些改良。试验中设置不同浓度的渗透
液，分别为 15%、12% 和 9% 的甘露醇溶液，在
渗透液中加入0.05% (W/V)果胶酶、0.05% (W/V)
纤维素酶和0.6% 的牛血清白蛋白(BSA)。选取刚
刚开放的颖花，用镊子夹碎花药，放入渗透液中
进行水合，花粉可直接吸水破裂。或者先将花粉
放入渗透液中水合，几分钟后将渗透液倾去，再
分别加入7.5%、6% 和 4.5% 的甘露醇低渗溶液，
进行冲击。
于显微镜下，用多个视野中破裂花粉占花粉
总数的百分率作为花粉的爆破率。分离的成对精
细胞用1 mg·L-1 荧光素二醋酸酯(FDA，厦门泰京
生物技术有限公司)测定其生活力；用1.5 mg·L-1
DAPI 溶液染色，观察释放的精细胞的细胞核；
用荧光显微镜(Leica DM R-60)观察花粉破裂和精
细胞的释放过程，并摄影。用 Leica DC 180 显
微操作仪可收集到较为纯化的精细胞群体。
实验结果
1 花粉的破裂和不同分离方法的比较
水稻成熟花粉在渗透液中发生轻微质壁分
离，有大约一半的花粉在浸入到渗透液中即吸水
膨胀而破裂，其内含物即从萌发孔处喷出或从花
粉裂开处喷出(图 1)；也有一些花粉在较长时间
(大约 3 min)吸水膨胀而破裂。在3种浓度的渗透
液中，以9% 甘露醇爆破效果较好(平均爆破率为
70.5%)，精细胞释放效果也最好。在渗透液中加
入少量酶液，可以将花粉中爆破出来的细胞质等
内含物酶解，而不破坏精细胞，并可将 2 个精细
胞之间的连接破坏，但 2 个精细胞仍保留在原来
的位置上，这样就容易进行精细胞的挑选。通过
试验证实，在渗透液中加入酶液后，能很好地分
离精细胞，而不需再用低渗溶液进行冲击，因为
2 个精细胞之间的连接已被酶解，如果再进行冲
击，则会将成对精细胞分开。
2 显微观察
2.1 细胞学观察 水稻成熟花粉中有2个精细胞，
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2个精细胞有大小差异，即精细胞的二型性(胡适
宜1990) (图2-a、h)。刚从花粉中释放的精细胞，
两两相连，有的可清楚看到 2 个精细胞呈现结构
上的连接(图 2-b)。刚释放的精细胞为长椭圆型
(图 2-c)，这时看不出其大小差异，在爆破几秒
钟后，精细胞就吸水变成圆球形，分散于介质
中。精细胞变为圆形时，可很明显地区分精细胞
的大小，也有极少数花粉释放出的一对精细胞很
难区分大小，对这种类型的精细胞通常不予选
择。花粉爆破后，仍然可观察到完整的雄性生殖 图1 光敏核不育水稻花粉粒的爆破(×300)
图2 光敏核不育水稻精细胞的分离
VN：营养核；Svn：与营养核相连的精细胞；Sua：不与营养核直接相连的精细胞。a：花粉破裂后释放的 2 个精细胞(×420);
b：1 对离体的精细胞，可清楚看到 2 个精细胞之间具结构上的连接(×1 250); c：刚释放出来的长椭圆型的精细胞(×1 600); d：
刚从花粉中释放的 1 对精细胞，FDA 染色(×1 375); e：水稻精细胞核，DAPI 染色(×1 500); f：用显微操作仪收集的大精细胞群
体(×375); g：用显微操作仪收集的小精细胞群体(×300); h：花粉破裂后释放的1 个营养细胞核和2 个精细胞(×2 000)。
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单位，这与苟小平等(1999)观察到的情况一致，
其中大的精细胞和营养核连在一起(图2-h)，随着
时间的延长，营养核也胀大、破裂。
2.2 精细胞活性鉴定 采用FDA荧光反应作为生活
细胞的标志，可以清楚的观察到精细胞呈现出均
匀的绿色荧光，说明分离的精细胞活性较好(图
2-d)。DAPI 染色后，在荧光显微镜下，分离的
精细胞核发出明亮的蓝色荧光(图2-e)。在渗透液
中加入 BSA 可延长精细胞的生活力。在加入 BSA
保护剂 3 h 后，我们见到其精细胞仍然保持较高
的亮度，不加 BSA 保护剂的水稻精细胞的 FDA 荧
光亮度减弱。
3 2个精细胞群体的分离
在渗透液中加入微量的酶液[0.05%果胶酶和
0.05%纤维素酶]后，取成熟的水稻花粉，放入渗
透液中直接爆破。在酶的作用下，成对的精细胞
之间联系消失，但 2 个精细胞仍保留在原来的位
置，这样就可以用显微操作仪收集精细胞群体。
分离的较大精细胞(Svn)直径为 7~9 mm，较小的
精细胞(Sua)直径为6~8 µm。苟小平等(1998)报道
从水稻中分离的精细胞直径在5~7.5 µm，由此可以
看出不同品种水稻的精细胞大小是有差异的。
讨 论
在我们的试验中观察到，花粉在渗透液中爆
破后，其内含物呈团状，精细胞很难从中释放出
来；当用低渗溶液进行冲击，也只有较少的精细
胞从成团的细胞质和淀粉粒中释放出来；如在渗
透液中加入少量的酶液，然后进行花粉爆破，这
样的效果较好，细胞质和淀粉粒都逐渐分散开
来，并很快释放出成对的精细胞。
有报道认为刚释放的水稻精细胞呈现长的尾
状延伸(苟小平 1998)，但在本试验中未观察到，
推测可能是渗透液的浓度较低和精细胞吸水较快之
果，如果提高渗透液的浓度则可观察到精细胞的
最初状态，但花粉爆破的效果可能会受到影响。
本试验中观察到的‘农垦 58S’精细胞，其
二型性与苟小平等(2001)认为未分离的水稻精细胞
没有二型性的结果不一致，说明精细胞的二型性
可能是因品种而异。关于试验中观察到刚刚释放
的长椭圆型精细胞看不出大小差异问题，我们认
为，精细胞本来的大小差异可能就不大，所以，
长椭圆型精细胞无法准确测量，也很难从外型上
辨别大小，而当精细胞吸水变为圆形时，就能看
出 2 个精细胞的大小差异，本文中的 2 个精细胞
差异在 0.5~1 µm。总之，我们分离得到了水稻
品种‘农垦 58S’的精细胞，并可从中挑选出一
定数量的 2 个精细胞群体，这为进一步研究水稻
离体受精奠定了基础。
参考文献
苟小平, 唐琳, 颜钫, 陈放(2001). 水稻精细胞的超微结构. 四川大
学学报, 38 (3): 434~439
苟小平, 王胜华, 陈放(1998). 水稻生活精细胞的大量分离. 四川
大学学报, 35 (6): 942~945
苟小平, 王胜华, 陈放(1999). 水稻生活精细胞的分离及细胞学
观察. 植物学报, 41 (6): 669~671
胡适宜(1990). 雄性生殖单位和精子异型性研究的现状. 植物学
报, 32 (3): 230~240
Khalequzzaman M, Haq N (2005). Isolation and in vitro fusion of
egg and sperm cells in Oryza sativa. Plant Physiol Biochem,
43: 69~75
Russell SD (1986). Isolation of sperm cells from pollen of Plum-
bago zeylanica. Plant Physiol, 81: 317~319