全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 4期，2008年 8月 715
刺五加体细胞胚 cDNA文库的构建
刘立琨, 李成浩 *, 李俊秀, 阎秀峰
东北林业大学生命科学学院, 林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
提要: 以 2,4-D处理的刺五加体细胞胚为实验材料, 提取总 RNA并分离mRNA合成 cDNA, 连接到 pAP3neo Predigested载
体上。采用电穿孔法将重组质粒转化到DH10B中。经测定, 原始文库滴度为 2.3×106 pfu·mL-1, 重组率大于95%。插入片段
的长度大部分在 0.5~2.0 kb之间, 平均长度为 0.96 kb, 表明刺五加体细胞胚 cDNA文库已构建成功。
关键词: 刺五加; 体细胞胚发生; cDNA文库
Construction of cDNA Library from Somatic Embryo of Eleutherococcus
senticosus Maxim
LIU Li-Kun, LI Cheng-Hao*, LI Jun-Xiu, YAN Xiu-Feng
Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology of Ministry of Education, College of Life Science, Northeast
Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: Total RNAs were extracted from 2,4-D pretreated Eleutherococcus senticosus somatic embryos,
cDNAs were synthesized from isolated mRNAs and ligated into the pAP3neo Predigested vector. The recombi-
nant plasmids were transformed into Escherichia coli DH10B by electroporation. The library qualification evalu-
ation results showed that the titer was larger than 2.3×106 pfu·mL-1, the percentage of recombination >95%, the
size of most inserted fragments ranged between 0.5 kb and 2.0 kb, the average size was 0.96 kb. It indicated
that E. senticosus somatic embryo cDNA library was constructed successfully.
Key words: Eleutherococcus senticosus; somatic embryogenesis; cDNA library
收稿 2008-05-05 修定 2008-06-26
资助 国家自然科学基金(30 6 71 7 0 1)。
* 通讯作者(E-mail: chli0@163.com; Tel: 0451-82190607)。
刺五加为五加科(Araliaceae)的多年生落叶灌
木, 主要分布在我国东北部、俄罗斯远东地区及日
本北海道等地, 是极其珍贵的药用植物。刺五加体
细胞胚发生具有诱导率高、繁殖系数大和容易实
现同步化发育等优点, 有望成为研究体细胞胚发生
机制的又一模式植物(Choi等 1999)。刺五加体细
胞胚的研究多集中在体细胞胚发生机制(Choi等
2001; Chakrabarty等 2003; You等 2006)、苗木快
速繁殖(Choi等 1999)、体细胞胚的生物反应器培
养和次生代谢产物生产(Shohael等 2007)、代谢途
径的分子调控(Seo等 2005)等方面的研究, 但刺五
加体细胞胚发生过程中基因表达调控的研究还很
少。本文以刺五加体细胞胚为材料, 以 pAP3neo为
载体, 用加EcoRI-SmaI接头定向克隆的方法, 构建
刺五加体细胞胚cDNA文库, 以期为采用基因芯片
技术研究刺五加体细胞胚发生的表达谱以及克隆体
细胞胚发生相关基因建立基础性资料。
材料与方法
刺五加(Eleutherococcus senticosus Maxim)成
熟种子接种于不含植物生长调节物质的MS培养基
上, 在 37 ℃下培养 5 d后转到 25 ℃下培养; 诱导形
成的体细胞胚继代于相同配比的MS培养基上培
养, 筛选出次生胚发生能力高的细胞系, 并以重复
体细胞胚发生的方式增殖和维持(李成浩等2006)。
将以上述方法维持近 7年的体细胞胚转到添加 1
mg·L-1 2,4-D的MS培养基上培养 5 d后取样, 以液
氮速冻, 保存于-80 ℃冰箱中备用。PolyATtract
Isolation System III为Promega公司产品, cDNA Li-
brary Construction Kit为TaKaRa公司产品, DL2000
DNA分子量标准、Taq DNA聚合酶和 dNTP购自
TaKaRa公司, 其他试剂均为国产分析纯。
提取刺五加体细胞胚总 RNA时, 在无 RNase
的 1.5 mL离心管中加入 600 µL SDS缓冲液[2%
SDS、200 mmol·L-1 NaCl、4 mol·L-1尿素、50
mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8.0)、10 mmol·L-1 EDTA (pH
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8.0)]、10%的 β-巯基乙醇。取 200 mg体细胞胚,
于液氮中研磨成粉末, 迅速加入这一反应体系中。
然后加入 300 µL Tris平衡酚和 300 µL氯仿, 震荡
15 min后, 于 4 ℃下以 13 000×g离心 15 min, 取出
放在冰上冷却 1 min; 取上清液, 再加 Tris平衡酚、
氯仿各350 µL, 重复抽提1次; 取上清液, 向其中加
入700 µL氯仿, 震荡5 min, 于4 ℃下以13 000×g离
心 5 min; 取上清液, 然后加入 1/2体积的 75%乙醇
与1/2体积的8 mol·L-1 LiCl, 混匀后, 于-20 ℃下沉
淀 30 min; 再于 4 ℃下以 13 000×g离心 20 min, 弃
去上清液; 用 75%的乙醇(预冷)洗涤 2次, 空气中
干燥后, 用适量的DEPC水溶解沉淀, 置于-80 ℃
下保存备用。以1.1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA
的完整性, 用紫外分光光度计法鉴定和测定RNA的
纯度和含量。
用 Promega公司的 PolyATtract Isolation Sys-
tem III分离纯化mRNA; 在得到的mRNA中加入
1/10体积的3 mol·L-1 NaAc与等倍体积的异丙醇混
匀, -20 ℃中沉淀过夜; 次日以15 000×g离心30 min,
出现的白色沉淀用 70%和 100%乙醇分别洗一次
后, 溶于 8 µL无 RNase水中。
按照TaKaRa cDNA Library Construction Kit说
明书, 在无菌的PCR管中, 加入5 µg刺五加mRNA,
再加入无 RNase水使总体积达到 10.8 µL, 在新的
小管中依次加入 4 µL 5×第一链合成缓冲液、1.2
µL第一链 dNTP Mix、1 µL RNase抑制剂、2 µL
Oligo(dT)18锚定引物, 将冰浴的mRNA溶液加入上
述反应液中, 加入1 µL M-MLV反转录酶, 轻轻混匀
后于 42 ℃中反应 2 h。在第一链 cDNA合成液中
依次加入 30 µL 5×第二链合成缓冲液、4.5 µL第
二链 dNTP Mix、87.5 µL RNase-free H2O、2 µL
E. coli RNase H、2 µL E. coli DNA聚合酶 I, 合成
cDNA第二链。
用 T4聚合酶将双链 cDNA末端平滑化, 与
Adaptor连接, 在合成的双链两端加上 EcoRI-SmaI
接头, NotI酶切, 将酶切产物经过自旋柱去除 400
bp以下的短链 cDNA。
载体连接及文库构建时, 将已纯化的分别带有
EcoRI和 NotI粘性末端的 cDNA与 100 ng EcoRI-
NotI酶切载体 pAP3neo进行连接, 12 ℃下过夜反
应。用电转化法将连接产物导入 E. coli DH10B,
构成原始文库。转化电压为 1 500 V。
原始文库滴度测定时, 取10 µL原始文库菌液
用 SOC液体培养基连续稀释 10、102、103倍, 然
后各取 10 µL涂布在 LB/Amp琼脂平板培养基上,
37 ℃下过夜培养。计算文库滴度(pfu·mL-1)=(菌落
数×稀释倍数)/受体菌的体积。
将原始文库按每个平板产生5×104个以下的克
隆涂布, 37 ℃中过夜培养, 收集每个平板的菌液, 此
为扩增文库。将扩增后的 cDNA文库稀释 105, 取
10 µL铺板, 计算扩增后文库滴度。文库扩增后加
25%甘油置于-80 ℃下保存。
cDNA文库插入片段的检测时, 从LB/Amp琼
脂平板上任意挑选 14个单菌落, 使用试剂盒中的
T7、T3引物进行 PCR反应, 1.2%琼脂糖凝胶电
泳鉴定插入片段的大小。
实验结果
1 刺五加体细胞胚中RNA的提取
SDS试剂提取总RNA, 经核酸测定仪测定其紫
外吸收值, OD260/OD280为 2.06, 说明 RNA质量较
好。琼脂糖凝胶电泳显示 28S和 18S条带清晰, 无
扩散, 比例接近 2:1说明 RNA完整, 可以用于构建
文库(图 1)。
图 1 刺五加体细胞胚总RNA的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.1 Agarose gel electrophoretogram of total RNAs from
somatic embryos of E. senticosus
2 mRNA的分离纯化
采用 Promega公司的 PolyATtract Isolation
System III分离纯化mRNA, 得到的mRNA在1%琼
脂糖凝胶中电泳, 扩散区带在 0.5~2.0 kb之间, 且
18S和 28S rRNA处的 2条特征带变得模糊, 说明
分离得到的mRNA质量较好(图 2)。
3 cDNA的合成和分析
cDNA第一链和第二链合成后, 在 1%琼脂糖
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图 3 刺五加体细胞胚 ds cDNA的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.3 Agarose gel electrophoretogram of ds cDNAs from
somatic embryos of E. senticosus
1: ds cDNA; M: DL2000 DNA分子量标准。
凝胶上电泳, 结果显示合成的cDNA最大长度大于
2.0 kb, 表明合成的 cDNA质量较高(图 3)。
4 cDNA文库的质量鉴定
将菌液稀释后测定文库中原始滴度的结果显
示, 原始文库滴度为 2.3×106 pfu·mL-1。扩增后的
cDNA文库稀释 105, 取出 10 µL涂平板, 计算扩增
后的滴度为 5.1×109 pfu·mL-1。从 LB/Amp琼脂平
板上任意挑选14个单菌落检测插入片段的大小, 电
泳结果显示插入的片段大部分在 0.5~2.0 kb之间,
平均长度为 0.96 kb (图 4)。
讨　　论
文库的滴度、重组率及插入片段的大小是鉴
定 cDNA文库的重要指标(杨成君等 2007)。本文
所获得的刺五加体细胞胚 cDNA文库原始滴度为
2.3×106 pfu·mL-1, 扩增后的文库滴度为 5.1×109
pfu·mL-1, 插入片段平均长度为 0.96 kb, 重组率大
于 95%。这些数据说明此文库能够满足构建完整
文库的要求。
提取纯度高、完整性好的RNA是构建高质量
cDNA文库的前提。本文曾使用传统的 CTAB、
SDS、Trizol法提取刺五加RNA, 但效果都不理想,
表现为 RNA提取的量少、易褐化、沉淀难溶于
水(资料未列出)。这可能与上述方法大多适用于
草本植物有关, 而刺五加在组成成分和结构特点上
不同于草本植物, 具有更为坚硬的细胞壁, 含有更
多的多糖和多酚化合物等物质。本文中, 采用改进
的 SDS法可以得到高质量的 RNA, 表现在: (1)材
料在提取液中经过强烈的震荡; (2)适当增加提取液
中 β-巯基乙醇的含量; (3)可用 LiCl代替乙醇沉淀
RNA。
图 2 总RNA中分离纯化的mRNA琼
脂糖凝胶电泳图谱
Fig.2 Agarose gel electrophoretogram of mRNAs
isolated from total RNAs
1: mRNA; M: DL2000 DNA分子量标准。
图 4 刺五加体细胞胚 cDNA文库插入片段的 PCR检测
Fig.4 PCR detection of inserted fragments size from somatic embryos of E. senticosus cDNA library
1~14: cDNA插入片段; M: DL2000 DNA分子量标准。
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采用 TaKaRa公司的 cDNA Library Construc-
tion Kit构建cDNA文库时, 通常在合成cDNA第一
链前, 将RNA溶液在 65 ℃下加热 5 min, 然后冰中
急冷 5 min, 认为这样能够缓解二级结构的影响。
但是这种加热处理容易导致RNA降解而降低文库
质量。本文构建刺五加体细胞胚 cDNA文库时, 未
对 RNA进行 65 ℃热变性处理, 直接用于 cDNA第
一链的合成, 反转录效果良好。
总之, 刺五加体细胞胚 cDNA文库的建立, 为
深入研究刺五加体细胞胚发生机制、体细胞胚诱
导过程中胚性细胞形成的特异机制以及体细胞胚诱
导过程中的基因表达等问题可能都有意义。
参考文献
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