全 文 ：植物生理学通讯 第 41卷 第 2期，2005年 4月208
番茄衰老相关蛋白SENU3 在大肠杆菌中的表达及其抗体制备
赵永娟* 王傲雪* 贾琪 华子春**
南京大学医药生物技术国家重点实验室，南京210093
Expression of Tomato Senescence-associated Protein SENU3 in Escherichia
coli and Preparation of Its Polyclonal Antibody
ZHAO Yong-Juan*, WANG Ao-Xue*, JIA Qi, HUA Zi-Chun**
The State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology, Nanjing University, Nanjing 210093
提要 研究了 SENU3 蛋白表达载体的构建、大肠杆菌表达、纯化及其抗体的制备。
关键词 番茄衰老相关蛋白 SENU3；原核表达；割胶 - 电洗脱法；多克隆抗体
收稿 2004-06-21 修定 2004-10-25
资助 国家自然科学基金(20373026、3042509、30330530、
30270291)。
*两位作者对论文同等贡献。
** 通讯作者(E-mail: zchua@nju.edu.cn, Tel：025-83324605)。
植物的衰老是受细胞特定基因控制的主动的
细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD) 的过
程。人们已分离出许多与衰老有关的基因
(senescence-associated genes, SAGs)，如编码
RNase、蛋白酶、脂酶的基因[1]等。另外，Rachel
等[2]从番茄中分离得到编码半胱氨酸蛋白酶基因
senu3，其 mRNA 的含量随着衰老程度的增加呈上
调趋势，其编码的蛋白序列与已知的半胱氨酸蛋
白酶有 40%~70% 的同源性[2]。现已查明，senu3
的 GenBank 登陆号为 z48736，又名 cyp-3。其
cDNA全长 1 388 bp，预测编码356个氨基酸，其
C端218个氨基酸(对应cDNA 431~1 087位)为成熟
肽，理论分子量为 23.34 kD。目前，SENU3 的
研究仍处于核酸水平，其结构和功能特征还不清
楚，可能参与植物衰老的信号转导过程。为了研
究SENU3 的生物学功能、鉴定与其相互作用的蛋
白质，我们构建了 SENU3 的大肠杆菌表达载体，
实现了其在大肠杆菌中的表达和分离纯化，以其
免疫家兔并获得了免疫特性较好的抗体，现报道
如 下 。
材料与方法
1 材料与试剂
表达载体 pNJUTRX-1[3]，大肠杆菌 Top10、
BL21(DE3)均为本实验室保存；番茄(Lycopersicon
esculentum Mill.)品种为中蔬5号，来自中国农业
科学院；家兔(雄性，2 kg)购自南京医科大学；
限制性内切酶、Pyrobest高保真DNA聚合酶、Taq
D N A 聚合酶、T 4 连接酶、D N A 分子量标准
(DL2000)购自 TaKaRa 公司；Trizol 试剂购自
Invitrogen公司；AMV RTase、DNase I、RNasin
购自 Promega 公司；IPTG 购自上海生工；DNA
回收试剂盒购自上海华舜生物工程公司；完全弗
氏佐剂购自 GIBCO 公司；PVDF 膜购自 Amersham
公司；抗兔IgG(HRP)购自 Santa Crutz公司；辣
根过氧化物酶发光底物购自 Amersham 公司。
2 方法
2.1 引物设计与合成
参考GenBank(登陆号：z48736)中的senu3基
因的序列，设计出扩增 senu3 片段的引物 P1(5
cgcggatccctgccagagacgaaagactg 3)、P2(5
ccggaattcttaggcaacgattgggtaggatg 3)，其5端分别
加上 BamHI 和 EcoRI 酶切位点。引物由上海基
康生物有限公司合成。
2.2 senu3基因的克隆和pNJUTRX-1-SENU3重组
质粒的构建
2.2.1 用RT-PCR方法扩增senu3基因 取0.5 g番
茄叶片组织，在液氮中研碎，按照Invitrogen公
司 Trizol 说明书提取总RNA，然后进行反转录和
PCR 扩增。PCR 反应体积为50 mL。PCR 参数为：
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94℃ 5 min；94℃ 50 s，55℃ 1 min，72℃ 1
min，30 个循环；最后 72℃延伸 7 min。使用
TaKaRa的Pyrobest高保真聚合酶。扩增产物进行
1.0% 琼脂糖凝胶电泳分析，回收 DNA 按上海华
舜公司试剂盒说明书进行。
2.2.2 pNJUTRX-1-SENU3重组质粒的构建 获得
的相应senu3 片段用 BamHI/EcoRI 双酶切，将其
克隆在经酶切(BamHI/EcoRI)的pNJUTRX-1非融合
表达质粒中[3]，转化 Top10 感受态细胞。所得克
隆经过 PCR、酶切以及测序鉴定。感受态制备、
转化、质粒抽提、双酶切筛选阳性重组子等均按
常规分子克隆方法或试剂盒说明书进行。
2.3 重组蛋白的大肠杆菌表达和纯化
2.3.1 重组蛋白的小量表达 重组质粒pNJUTRX-
1-SENU3 转化 BL21(DE3)，挑取单菌落培养至
OD600 为 0.5~0.6，IPTG诱导表达3 h，收集菌体，
超声破碎细胞(Heat-Systems-Ultrasonics公司W-
375型超声仪，20×10 s, 30%功率输出)，在 4℃
下，12 000×g离心 20 min，取上清液和沉淀，以
SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定。
2.3.2 重组蛋白的大量表达及纯化 确定目的蛋白
获得表达后进行大规模诱导表达，超声后分离的
沉淀用制备型 SDS-PAGE 进行分离，KCl 染色，
割取目的蛋白条带，置于中分子量透析袋(截流分
子量15 kD)中进行电洗脱，冻干，透析后以SDS-
P A G E 分析纯度和产量。
2.4 SENU3多克隆抗体的制备及鉴定
2.4.1 多克隆抗体的制备 取400 mg纯化的SENU3
蛋白，经等体积(约 1 mL)的完全弗氏佐剂乳化
后，免疫家兔。3 周后加强免疫，2 周 1 次，每
次 300 mg 蛋白，共 4 次。第 3、4 次免疫前耳
缘静脉采血，用免疫双扩散法测定效价。第 4 次
免疫后 2 周，颈动脉放血，免疫血清加 NaN 3 至
终浓度 0.02%，分装存于 -80℃温度中。
2.4.2 多克隆抗体的鉴定
采用免疫双扩散[4]和Immunodotting[5]的方法
测定血清抗体效价。
用Western blot的方法鉴定抗体的特异性。
BL21(DE3)[pNJUTRX-1-SENU3]表达菌体总蛋白和
番茄叶片总蛋白(取叶和提取分别参考文献6、7)
经 SDS-PAGE 后电转移至 PVDF 膜上，以 10% 脱
脂奶粉 PBST 溶液封闭 1 h，1∶400 加抗血清，
置室温下 1 h，用 PBST 洗 10 min，共 6 次，加
山羊抗兔IgG-HRP，室温下反应1 h 后，以 PBST
洗 10 min，共 6 次，再加发光底物反应后用 X-
光片压片记录结果。
实验结果
1 senu3 cDNA片段的扩增与克隆
用 RT-PCR 的方法从番茄叶片中扩增得到约
650 bp的目的片段，纯化后用BamHI/EcoRI双酶
切克隆至 p N J U T R X - 1 中，获得的重组质粒
pNJUTRX-1-SENU3(图 1)，经 PCR 双酶切鉴定同
预期结果相符(图2-a)。其中插入的senu3 cDNA片
段经测序，结果与报道序列[2]完全符合。
2 大肠杆菌的SENU3蛋白表达和纯化
挑取 BL21(DE3)[pNJUTRX-1]和 BL21(DE3)
[pNJUTRX-1-SENU3]的单菌落，培养至菌浓度为
OD600 0.5~0.6时用 IPTG 1 mmol·L-1 开始诱导，于
37℃下诱导 3 h 后，收集菌体，超声破碎，取上
清液和沉淀，以 SDS-PAGE 鉴定。结果(图 2-b)
显示，和空载质粒相比较，重组表达质粒在 2 3
kD 左右显著增加1条蛋白质条带，这与SENU3 蛋
白的预测分子量一致，大部分目的蛋白存在于超
声沉淀(即包涵体)中。取沉淀以割胶-电洗脱法纯
化，纯化结果见图 2-c。通过扫描计算出蛋白溶
液浓度为19.07 mg·mL-1，产量为7 628 mg·L-1(菌)。
3 SENU3多克隆抗体的制备和鉴定
3.1 免疫双扩散 如图3-a所示，在琼脂板中央孔中
加入200 mg·mL-1 SENU3 蛋白溶液，周边孔加入
等体积经PBS(pH 7.2)稀释后的抗血清(最后放血所
图1 pNJUTRX-1-SENU3 重组表达质粒图谱
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得)，于室温下扩散18~24 h后观察结果，按1∶8
的比例稀释后仍可见到沉淀线。
3.2 Immunodotting 按图3-b所示的倍比稀释抗
原(1倍浓度为0.6 mg·mL-1)，点于PVDF膜上进行
免疫检测反应，一抗按 1∶100 稀释。抗原上样
量约为 19 ng 时，仍有斑点出现。
3.3 Western blot 取抗血清做Western blot试验，
按1∶400 比例稀释，样品分别为 IPTG 诱导的含
有质粒 pNJUT RX-1 或 pNJU TRX-1-SE NU3 的
BL21(DE3)菌体总蛋白(图3-c)以及番茄 3个不同
发育阶段的叶片总蛋白溶液(图 3-d)。结果表
明该抗血清的特异性可达到很高水平。
总之，本文采用 RT-PCR 从番茄叶片中克隆
senu3 cDNA 重组于非融合表达质粒 pNJUTRX-1
中，在大肠杆菌中获得高效表达。经过纯化后免
疫家兔，成功地制备了 SENU 3 蛋白的多克隆抗
体。免疫双扩散以及immunodotting的结果表明，
该抗体具备较高的效价。重组质粒原核表达总蛋
白和番茄叶片总蛋白的Western blot结果都表明该
抗体具有较好的特异性。这为下一步研究番茄中
SENU3 的表达并进一步阐明番茄衰老的相关机理
建立了技术基础。
使用该方法制备多克隆抗体时有几点值得注
意：(1)纯化方法的选择：当表达量很高时，用
此法可以得到很高纯度的蛋白质；但目的蛋白的
表达量不高时容易回收到其它蛋白质，建议采用
其它纯化方法；( 2 )血清的保存：建议分装后
在 -80℃下作长期保存，如经常使用则在4℃下保
存即可，以防止反复冻融。
参考文献
1 沈成国. 植物衰老生理与分子生物学. 北京:中国农业出版社,
2001.138~155
2 Rachel D, Isaac J, Aldo F et al. Isolation and analysis of
cDNA encoding tomato cysteine proteases expressed during
leaf senescence. Plant Mol Biol, 1996, 30:755~767
3 Yang S, Zhao JH, Hua ZC. pNJUTRX-1, a thioredoxin
bicistron expression vector for enhancement of solubility of
recombinant proteins expressed in Escherichia coli. 南京大
学学报(自然科学), 2000, 36(4):511~514
4 赵会英, 郑俊民, 卞生杰等. 蛇毒降纤酶多克隆抗体的制备
及其某些性质.沈阳药科大学学报, 2001, 18(1):57~58
5 Maria TE, Nilda EF. Purification and partial biochemical
characterization of an S-type lectin from blastula embryos
of Bufo arenarum. Comp Biochem Physiol, 1996, 115B(2):
175~182
6 Isaac J, Rachel D, Aldo F et al. Delayed leaf senescence in
ethylene-deficient ACC-oxidase antisense tomato plants:
molecular and physiological analysis. Plant J, 1995, 7(3):
483~490
7 谷瑞升, 刘群录, 陈雪梅等. 木本植物蛋白提取和SDS-
PAGE 分析方法的比较和优化. 植物学通报, 1999, 16(2):
171~177
图 2 重组子 pNJUTRX-1-SENU3 的鉴定和表达纯化
a. pNJUTRX-1-SENU3 的鉴定：1. BamHI/EcoRI 双酶切；
2. SENU3 PCR 鉴定；3. DL2000 DNA 分子量标准(至上而
下：2 000、1 000、750、500、250、100 bp)。b. SENU3 的
大肠杆菌表达：1. 标准分子量蛋白(31 kD)；2. 阴性对照
(pNJUTRX-1)诱导表达的菌体总蛋白；3. pNJUTRX-1-SENU3
诱导表达，超声破碎得到的上清液；4. pNJUTRX-1-SENU3
诱导表达，超声破碎得到的沉淀。c. 蛋白 SENU3 的纯化与定
量：1. BSA(9 mg); 2. 纯化后的SENU3蛋白；3. BSA(6 mg); 4.
阴性对照(pNJUTRX-1)诱导表达的菌体总蛋白。
图3 多克隆抗体的鉴定
a. 免疫双扩散；b. immunodotting；c. 大肠杆菌表达
SENU3 的 Western blot 鉴定：1. BL21(DE3)[pNJUTRX-1-
SENU3]IPTG 诱导菌体总蛋白，2. BL21(DE3)[pNJUTRX-1]
IPTG 诱导菌体总蛋白；d. 番茄叶片总蛋白的Western blot 鉴
定：1. 嫩叶，2. 壮叶，3. 老叶。