全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月 705
苎麻细胞质雄性不育系与保持系线粒体DNA 的 ISSR 检测
侯思名1 段继强1 梁雪妮2 丁小维1 刘飞虎1,*
云南大学1生命科学学院，2 成人教育学院，昆明 650091
Detection for mtDNA of Cytoplasmic Male Sterile (CMS) Line and Maintainer
Line of Ramie [Boehmeria nivea (L.) Gaud.] by ISSR
HOU Si-Ming1, DUAN Ji-Qiang1, LIANG Xue-Ni2, DING Xiao-Wei1, LIU Fei-Hu1,*
1College of Life Sciences, 2College of Adult Education, Yunnan University, Kunming 650091, China
提要 采用蔗糖衬垫法提取苎麻雄性不育系与相应保持系的线粒体 DNA。选用了 38 个 ISSR 引物进行 ISSR-PCR 扩增，在
编号为 ISSR-29、33、34 引物中找到了苎麻不育系与相应保持系线粒体 DNA 之间的差异。
关键词 苎麻；线粒体 DNA 提取；蔗糖衬垫法；ISSR 检测
收稿 2005-12-12 修定　 2006-05-23
资助　 国家自然科学基金(30360058)。
*通讯作者(E-mail: plantbreed2004@yahoo.com.cn, Tel:
0871-5035256)。
作为最优良纤维作物之一的苎麻[Boehmeria
nivea (L.) Gaud.]，其雄性不育杂种优势利用正受
到普遍重视，而苎麻雄性不育的分子基础研究还
未见报道。植物雄性不育是杂种优势利用的基
础。前人的研究表明(Kadowaki 等 1990；李小明
等2000；Levings和Brown 1989；仇艳光等2001)，
植物雄性不育与线粒体基因组密切相关，因此研
究植物雄性不育多从线粒体DNA (mitochondrial
DNA, mtDNA)着手。有关 mtDNA 提取与纯化的
报道很多(刘杰等 2004；王学德2000；盖树鹏和
孟祥栋2000；陈学军等2003)，但由于各自的研
究目的和选取的研究材料不同，很难有一种通用
的提取与纯化方法。苎麻组织中，由于含有较高
含量的酚类、粘状物及黄酮类等次生代谢物质，
mtDNA 的提取与纯化相对较为困难。本文用蔗糖
衬垫法(sucrose-mediated sedimentation, SMS)提取
苎麻中 mtDNA，由于苎麻材料容易氧化变褐，所
以提取过程中添加了抗氧化物质，以求能得到较
高纯度的 DNA。所提取的 mtDNA 经 ISSR-PCR 电
泳扩增检测结果显示，苎麻雄性不育系与相应保
持系的 m t D N A 之间存在差异。现报道如下。
材料与方法
1 实验材料
实验材料为我们前期工作中培育的苎麻
[(Boehmeria nivea (L.) Gaud.)]不育系GS14-1 (A)和
对应保持系13-X2 (B)，采用扦插繁殖方法培育幼
苗，种植于云南大学植物改良与应用实验室育种
基地(昆明)。于营养生长期对植株打顶，去除顶
部的 3~5 片叶，套上 20 cm×30 cm 的黑色布袋，
20 d 左右可采黄化苗。黄化苗用无菌水冲洗干
净，用无菌纸吸干水分，- 7 0 ℃下保存。
2 实验试剂及主要仪器
主要试剂：MgCl 2、10×PC R 缓冲液、Taq
DNA 聚合酶、蛋白水解酶K、牛血清白蛋白(BSA)
购自上海生物工程公司，为Promega产品；DNaseI
为 Sigma 公司产品；dNTPs、Tris-HCl、EDTA-
Na2、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、b- 巯基乙醇购自杰
辉生物技术有限公司，为 Bebco 分装产品；ISSR
引物由上海博亚公司合成；其它试剂为国产分析
纯。主要仪器有 Epp e n d o r f 高速冷冻离心机、
Eppendorf PCR仪、北京六一仪器厂电泳槽、Bio-
Rad 电泳仪、WD-9403F 型紫外分析仪等。
3 试剂配制
缓冲液A：10 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 7.5)，
300 mmol·L-1 蔗糖，4 mmol·L-1 EDTA，0.2%
BSA，0.05% 的半胱氨酸，6% 的 PVP，4% 的 b-
巯基乙醇。缓冲液B：10 mmol·L-1 Tris-HCl (pH
7.5)，600 mmol·L-1 蔗糖；6% 的 PVP。裂解液
L：50 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8.0)，10 mmol·L-1
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EDTA，0.2% SDS，0.012% 蛋白酶 K。
4 mtDNA 的提取与纯化
苎麻mtDNA用蔗糖衬垫法提取，参考Scotti
等(2001)的方法，略有改动。
5 mtDNA 的检测
溴化乙锭染色法检测 mtDN A 的浓度。对提
取的 mtDNA 进行 1% 的琼脂糖凝胶电泳，并列设
置20~200 ng未经酶解的 lDNA，比较样品中DNA
条带与 lDN A 标准条带的亮度，初步估测样品
DNA 的浓度。最后把mtDNA 浓度调至50 ng·mL-1
待 用 。
6 ISSR-PCR 扩增
6.1 反应体系 总体积20 µL，其组成为：10×PCR
反应缓冲液2.0 µL、25 mmol·L-1 MgCl2 2.0 µL、
10 mmol·L-1 dNTPs 0.4 µL、Taq DNA聚合酶 1.2
U、2.5 µmol·L-1 的引物 2.0 µL、mtDNA 2 µL，
加灭菌蒸馏水至 20 µL，少量石蜡油密封。
6.2 扩增程序 94℃预变性5 min，然后94℃变性
40 s、52℃退火 50 s、72℃延伸 80 s，共 40个
循环，最后 72℃再延伸 7 min，保持在 4℃。
6.3 实验中所用到的引物 ISSR-29: 5 CGCC(GA)6
3；ISSR-33：5 GGA(GTG)4 3；ISSR-34: 5 CCA-
(GTG)4 3。
6.4 扩增产物的检测 取反应混合物5 µL，上样缓
冲液 3 µL，混匀，点入 1.0% 的琼脂糖凝胶中，
1×TAE 缓冲液，DYC-33B 型电泳槽，100 V 电压
下电泳 60 min，于紫外分析仪下观察照相。
实验结果
1 蔗糖衬垫法提取mtDNA
mtDNA 的提取方法中，黄化苗培养和裂解、
去蛋白为常规操作。线粒体和叶绿体可以利用其
沉淀系数的较大差异，通过差速离心而得以分
离。提取方法的关键是要彻底除去细胞核 DNA 对
线粒体的污染，才能获得较纯的 m t D N A。由于
苎麻组织中纤维含量较高，往往要用较强烈的机
械方法才能破碎细胞。在这过程中会打碎较多的
细胞核，释放出的细胞核会污染线粒体。针对这
个问题，通常采用手工研磨或用组织搅碎器以比
较温和的匀浆强度研磨，尽量减少细胞核的破
碎。通过差速离心和蔗糖密度梯度离心，把细胞
图1 蔗糖衬垫法提取的苎麻mtDNA
核和线粒体分离开。在裂解线粒体前用较高浓度
(100 µg·mL-1)的 DNaseI处理，除去线粒体外的核
D N A 的污染。另外，组织破碎时也会引起叶绿
体的破裂，破碎叶绿体释放的 D N A 也可通过
DNaseI 去除，再用酚去蛋白。
用蔗糖衬垫法提取 mtDNA，较之 CsCl 密度
梯度离心或蔗糖密度梯度离心方法提取 mtDNA 而
言，用分步的离心步骤取代了密度梯度的较难操
作过程，省时省钱，较为可取。实验证明，以
上 mtDNA 提取方法步骤简便，结果稳定(图 1)。
一般每100 g黄花苗可以得到20~30 µg的mtDNA。
图2 ISSR-29、33、34对苎麻不育系
和保持系 mtDNA 的扩增图谱
2 苎麻 mtDNA 的 ISSR-PCR 扩增
我们的实验曾用20个ISSR引物对以上苎麻两
系mtDNA 进行扩增，只有 ISSR-29、ISSR-33 和
ISSR-34 引物的扩增表现出差异。从图 2 可以看
出，引物ISSR-33 和 ISSR-34 扩增结果中，保持
系比不育系均多1条带；而ISSR-29扩增结果中，
不育系比保持系多 1 条带，反应出保持系和不育
系之间 mt D N A 的差异。
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讨　　论
苎麻组织中酚类、粘状物及黄酮类等次生代
谢物质的含量较多；纤维含量也较高，研磨比一
般植物更难，耗时更长。这些因素使得提取过程
中材料易于褐化，提取的 DNA 往往呈现褐色，在
用作 PCR 模板时难以获得满意的结果。为了防止
褐化，常用的办法是在提取缓冲液中添加抗氧化
剂。黄小英等(2001)在提取苎麻总DNA 的过程中
添加了 6% 的 PVP 和 2% 的 b- 巯基乙醇，得到了
较好的 DNA。李明芳(2003)在提取荔枝 DNA 的过
程中，向 CTAB 提取液中加入 1% 的 PVP 和 2% b-
巯基乙醇，所得基因组 D N A 为无色透明状，并
认为，虽然 PVP 和 b - 巯基乙醇单独作用效果不
好，但如将两者结合起来使用，则能得到较好的
结 果 。
我们的操作过程与以上做法基本相似，仅在
试剂配制时分别添加了适量的抗氧化性物质 PVP
和 b- 巯基乙醇，并在第1步即液氮研磨时添加了
少量具有稳定作用和抗氧化性的 PVP；在第 1 次
氯仿/异戊醇抽提后加入高盐溶液以去除多糖，这
样可防止提取过程中材料氧化变褐。
苎麻组织研磨不充分时，短碎纤维类物质会
悬浮于液体中，离心取沉淀时往往会带走部分沉
淀，而影响 D N A 的得率。研磨太充分时，提取
液中就会出现很多粘性成分，此时最好用至少 4
层纱布过滤，否则沉淀中会混有许多粘性物质，
以致沉淀无法分开。在取上清液的过程中，最上
面往往有一小层粘性如焦油类的物质，需要小心
加以去除，否则会混入下一次沉淀。
植物细胞质雄性不育(cytoplasmic male ste-
rilely, CMS)是mtDNA变异引起的(李传友和伏健民
1998)。不育系与保持系 mtDNA 之间的差异主要
有 2 类。第 1 种差异表现为组织结构和拷贝数的
差异，如Kadowaki 等(1990)发现 BT 型水稻不育
系、保持系线粒体atp6和cob基因Southern杂交
带型有差异，李大东和王斌(1990)发现atpA基因
不育系和保持系拷贝数不同等。第 2 种差异是有
与无的关系，即某一片段是不育系或保持系所
有。据Yamaguchi和Kakiuchi (1983)报道，BT型
是水稻不育系所特有，而保持系则缺少共价闭合
分子B1 (1.5 kb)与B2 (1.2 kb)。我们的试验结果属
于第 2 种情况。
比较不育系和保持系的差异可以用于寻找细
胞质特异位点，属于 CMS 性状与不育基因之间建
立联系的初步性工作。但这种差异是否也会表现
在mtDNA 的转录和翻译水平上，是否与细胞质雄
性不育有关，都待进一步研究。
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