全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第2期，2006年4月 281
蓝藻质粒DNA 提取方法的改进
童艳1,2 施定基1,3,* 冉亮3 张芃芃3 邓元告1 宋东辉1 赵兴贵1 张越男1
天津科技大学1 海洋科学与工程学院，2 生物工程学院，天津 300457；3 中国科学院植物研究所，北京 100093
A Improving Method for the Plasmid DNA Isolation from Cyanobacteria
TONG Yan1,2, SHI Ding-Ji1,3,*, RAN Liang3, ZHANG Peng-Peng3, DENG Yuan-Gao1, SONG Dong-Hui1, ZHAO Xing-Gui1,
ZHANG Yue-Nan1
1College of Marine Science and Engineering, 2College of Biology Engineering, Tianjin University of Sciences & Technology, Tianjin
300457, China; 3Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093, China
提要 以含 pMD-489-TNF 重组质粒的丝状体鱼腥藻 7120 和单细胞聚球藻 7002 为材料，比较了 SDS- 碱裂解法和 SDS 法
在蓝藻质粒提取中的效果，并对 SDS- 碱裂解法应用于蓝藻质粒提取作了一些改进和实验条件的优化。
关键词 蓝藻；质粒；SDS 碱裂法；SDS 法；溶菌酶
收稿 2005-11-21 修定　 2006-02-23
资助 天津市科委科技攻关重大项目(3015080)。
*通讯作者(E-mail: cyanoshi@126.com, Tel: 022-6060110)。
分离提取质粒是分子生物学和基因工程的关
键技术之一。提取大肠杆菌质粒的方法已经标准
化，而对蓝藻质粒的提取方法，国内报道很少，
国际上报道的方法受蓝藻种属限制，方法的普遍
适用性较差(Fiore等2000)。
蓝藻又称蓝细菌，其细胞结构与大肠杆菌相
似，其细胞壁与革兰氏阴性细菌相同( 吴国芳
1994)。由于蓝藻的细胞结构和遗传体系与大肠杆
菌相似，所以蓝藻成为至今唯一能转入外源基因
并高效而稳定表达的藻类。十几年来，我们在研
究用蓝藻基因工程制备重组药物和处理环境上取得
一些进展(施定基等2005); 在研究中深感提取蓝藻
质粒的重要和现有方法不合用带来的困难。在总
结前人研究经验的基础上，我们对丝状体和单细
胞蓝藻的质粒提取做了一些工作，积累了一些经
验，现初步报道如下。
材料与方法
1 材料
我们实验室构建并保存的含 pMD-489-TNF
(TNF即肿瘤坏死因子)重组质粒的淡水生长的丝状
体蓝藻鱼腥藻7120 (Anabaena sp. PCC 7120)和含
pMD-489-TNF 重组质粒的海水生长的单细胞蓝藻
聚球藻7002 (Synechococcus sp. PCC 7002)。
2 试剂
溶液Ⅰ：50 mmol·L-1 葡萄糖、25 mmol·L-1
Tris-HCl (pH 8.0)、10 mmol·L-1 EDTA、10
mg·mL-1 的溶菌酶；溶液Ⅱ：0.2 mol·L-1 NaOH、
1% (m/V) SDS；溶液Ⅲ：60.0 mL 5 mol·L-1
K AC、11.5 mL 冰乙酸、28.5 mL 去离子水(K+ 浓
度为 3 mol·L-1、AC- 浓度为5 mol·L-1); STE：10
mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8.0)、1 mol·L-1 EDTA、0.1
mol·L-1 NaCl；SE：50 mmol·L-1 Tris-HCl (pH
8.0)、5 mmol·L-1 EDTA、50 mmol·L-1 NaCl；
TE：10 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8.0)、1 mmol·L-1
EDTA、5 mmol·L-1 NaCl。
3 实验方法
3.1 改良的SDS-碱裂解法 (1)取培养至对数生长
中后期的含pMD-489-TNF 重组质粒的转基因鱼腥
藻 7120 和聚球藻 7002 各 4 mL，离心，弃上清
液，倒置离心管 1 min，尽量使培养液流尽。(2)
加入 1 mL SE 充分混匀，将内容物转入 1.5 mL
离心管内，离心，弃上清，倒置离心管 1 min，
尽量使管液体流尽。(3)加入150 mL含10 mg·mL-1
溶菌酶的溶液Ⅰ，充分混匀后 3 7℃下分别温育
0.5、1.0、1.5 h。(4)加入300 mL溶液Ⅱ(现配现
用)，轻轻混匀，冰浴 3 min。(5)方法一：加入
225 mL 溶液Ⅲ，充分混匀内容物，冰浴 5 min，
离心，取上清液，加入等体积的酚∶氯仿抽提
10 min，离心，取上清液；方法二：加入 225
mL 溶液Ⅲ，充分混匀内容物，冰浴 5 min，加
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入等体积的酚∶氯仿抽提 10 min，离心，取上
清。(6)加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置2.0 h
后，4℃下离心，收集沉淀。(7)加入 1 mL 70%
乙醇洗涤沉淀，4℃下离心5 min，倒置离心管1
min，使管壁液滴流尽，室温中放置约 15 min，
直至酒精挥发干净。(8)加入20 mL TE溶解质粒沉
淀，置于 - 2 0℃冰箱内待用。
3.2 SDS法 按Porter (1988)的方法进行。
4 琼脂糖凝胶电泳
取5 mL 质粒 DNA 溶液，在1.0% 的琼脂糖凝
胶电泳(缓冲液为1×TAE，90 V) 1.5 h 电泳后，
凝胶用溴化乙锭染色，在凝胶成像仪中观察、拍
照。
5 分光光度法测定DNA浓度
将所提质粒溶于 20 mL TE 中，稀释 100 倍
后，利用紫外分光光度计，测定样品在260和280
nm 波长处的吸收值。根据 260 nm 处的读数可计
算出样品中 DNA 的浓度，1 OD260=50 µg·mL-1，
根据 OD260/OD280 比值可估计 DNA 的纯度，OD260/
OD280 为 1.8 时说明样品较纯。样品DNA 浓度(µg·
mL-1)按下式计算：OD260×100× 稀释倍数(50)。
实验结果
1 改良的 SDS 碱裂解法与SDS 法提取效果比较
对采用两种方法提取的质粒进行琼脂糖凝胶
电泳，结果(图 1、2)显示，无论是对鱼腥藻7120
还是对聚球藻7002，采用 SDS 法提取的质粒，电
泳条带模糊不清，含杂质较多。而 S D S 碱裂解
法采用不同的抽提方法，提取效果也差别很大：
加入溶液Ⅲ后直接加酚∶氯仿抽提，所提质粒电
泳条带模糊；而采用正常的抽提方法，即加入溶
液Ⅲ后离心，取上清，加酚∶氯仿抽提，所提
质粒电泳条带明显清晰，几乎无杂质污染。
2 加入含溶菌酶的溶液Ⅰ温育不同时间对重组质
粒提取的影响
采用改良的SDS碱裂解法(加入溶液Ⅱ后采用
方法二)进行质粒提取时，加入含溶菌酶的溶液Ⅰ
后，分别温育 0.5、1.0、1.5 h。所提的质粒溶
于20 mL TE 后，取 7 mL进行琼脂糖凝胶电泳并
利用紫外分光光度计测定 DNA 浓度，结果(图 3、
4和表1)显示，加入溶菌酶后温育1.5 h，提取的
质粒比较干净，含杂质少。
图1 改良的SDS碱裂解法与SDS法所提转TNF
基因鱼腥藻7120质粒的电泳图谱
1：SDS 碱裂解法(加入溶液Ⅲ后直接加酚∶氯仿抽提)提
取的质粒；2：采用 SD S 碱裂解法(加入溶液Ⅲ后离心，取上
清，加酚∶氯仿抽提)提取的质粒；3：S D S 法提取的质粒；
4：l-Hind Ⅲ DNA 分子量标准。
图3 加入溶菌酶后不同温育时间所提取的转TNF
基因鱼腥藻7120质粒的电泳图谱
1：l-Hind Ⅲ DNA 分子量标准；2：温育 0.5 h；3：
温育 1.0 h；4：温育 1.5 h。
图 2 改良的SDS碱裂解法与SDS法所提转TNF
基因单细胞聚球藻7002质粒的电泳图谱
1：SDS 碱裂解法(加入溶液后直接加酚∶氯仿抽提)提取
的质粒；2：S D S 碱裂解法(加入溶液Ⅲ后离心，取上清，加
酚∶氯仿抽提) 提取的质粒；3 ：S D S 法提取的质粒。
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图4 加入溶菌酶后不同温育时间所提取的转TNF
基因聚球藻7002质粒的电泳图谱
1：l- Hind Ⅲ DN A 分子量标准；2：温育 0.5 h；3：
温育 1.0 h；4：温育 1.5 h。
表1 不同温育时间下从鱼腥藻7120及聚球藻7002中所提取的重组质粒DNA的浓度

温育时间/h
鱼腥藻7120 聚球藻7002
OD260 OD280 OD260/OD280 DNA浓度/mg·mL-1 OD260 OD280 OD260/OD280 DNA浓度/mg·mL-1
0.5 0.011 0.006 1.83 0.055 0.006 0.003 2.00 0.030
1.0 0.014 0.008 1.75 0.070 0.011 0.006 1.83 0.055
1.5 0.016 0.008 2.00 0.080 0.013 0.007 1.86 0.065
讨　　论
分离纯化质粒DNA 的关键是将染色体 DNA 与
质粒 DNA 完全分离。染色体 DNA 与质粒 DNA 虽
然都为脱氧核糖核苷酸的多聚体，且结构都为双
螺旋，但由于二者在形态和结构上仍然存在着细
微差别，因而这种完全分离遂成为可能。两者的
差别具体体现在：一是染色体的 DNA 大大长于通
常能作为载体的质粒 DN A，一般质粒 D N A 的长
度为染色体的 0.01% ~2%。在细胞裂解过程中，
长链的基因组DNA就会被共沉(贺淹才1998)。二
是染色体 DNA 与质粒 DNA 在拓扑结构上存在明显
不同，因此在抽提质粒的过程中，染色体 D N A
不仅氢键会破坏，其双链还易解离成单链，即使
条件恢复正常，也不能复性。而质粒 D N A 的氢
键虽然也会被破坏，但其双链只部分发生解离，
当条件恢复正常时，超螺旋闭合环状的质粒又会
复性(贺淹才1998)。本文采用的改良的SDS碱裂
解法就是立足于质粒 DNA 与染色体 DNA 的这两个
差别，利用溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的特殊作
用，达到质粒 DNA 和染色体 DNA 的分离，从而
纯化出质粒 D N A 。
SDS 碱裂解法的原理主要基于 3 种裂解液的
应用：溶液Ⅰ的主要作用为控制反应的pH值，促
进细胞壁的溶解，增加细胞比重以帮助细胞悬
浮；溶液Ⅱ的主要作用为使长链基因组 DNA 解链
变性，并与细胞裂解后释放的蛋白质、细胞碎片
相互缠绕成大型复合物，再被溶液中的 SDS 包盖
住，而部分超螺旋的闭合环状质粒 DNA 在此时也
会发生可逆变性；溶液Ⅲ的主要作用是使管内体
系恢复中性条件，从而使质粒 DNA 复性，同时，
加入溶液Ⅲ后形成的十二烷基磺酸钾(PDS)会把
SDS 包盖的大型复合物共沉下来，通过离心，可
以与上清中的质粒 DNA 分离开来。
长期以来，由于蓝藻中重组质粒拷贝数较
低，提取较为困难，提取的质粒在量和质上有时
难以保证酶切、转化等进一步的实验操作，给外
源基因的鉴定带来了一定的不便。本文将用于大
肠杆菌质粒提取的 SDS 碱裂解法应用于蓝藻质粒
提取，并根据蓝藻的细胞结构特点，作了如下的
改 进 ：
(1)考虑到蓝藻细胞壁外有含果胶酸和粘多糖
构成的胶质鞘(吴国芳1994)，这些物质会影响裂
解液对细胞壁的破裂，所以在细胞壁破裂前先用
SE洗涤细胞，除去其细胞表面的多糖成分(Fiore
等 2000)，破坏胶质鞘，因而细胞壁易于破裂。
(2)加入溶液Ⅲ后作了两步处理：一是充分混
匀溶液，冰浴 5 min 后离心，取上清液，再以
酚∶氯仿抽提；二是加入 225 mL 溶液Ⅲ后直接
以酚∶氯仿抽提(李和伟等1995)。两种抽提方法
得到的质粒作电泳分析(图1)，由电泳图谱可以看
出，采用第 1 种处理方法获得的质粒含杂质较
少，电泳条带干净清晰；而第 2 种处理方法虽简
化了操作步骤，节省了提取时间，但得到的质粒
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混杂有大量的大片段染色体 D N A ，电泳条带模
糊，因而不宜采用。
(3)蓝藻细胞壁较难破裂，其细胞壁结构与革
兰氏阴性细菌的细胞壁一样，可为溶菌酶溶解(吴
国芳 1994)。所以，我们除了用 NaOH 外，在加
溶液Ⅰ时加入了终浓度10 mg·mL-1 的溶菌酶，以
促进其细胞壁破裂。我们同时注意到，温育 1.0
h 以后，管内物质开始由绿变蓝，显示蓝藻细胞
内藻蓝蛋白已释放出来，细胞壁也因而破裂。而
电泳结果也显示(图 3、4)，如果溶菌酶处理时间
不足，细胞壁破裂会不完全，胞内物质不能充分
释放，最终可能会减少质粒的提取量，所提质粒
杂质也会较多。
(4)选择了淡水生长的丝状体蓝藻鱼腥藻7120
和海水生长的单细胞蓝藻聚球藻7002为材料，目
的在于了解改良后的 SDS 碱裂解法是否有普遍的
应用价值，答案是肯定的。改良后的 S D S 碱裂
解法无论是对淡水生长还是海水生长、丝状体还
是单细胞的蓝藻都有较好的提取效果。而该方法
对淡水生长的丝状体鱼腥藻7120有更好的提取效
果，收集同体积的藻细胞，所得质粒沉淀较海水
生长的单细胞聚球藻 7002 多，电泳条带更加清
晰，更容易鉴定。
虽然本方法行之有效，但如果操作不当，往
往也会失败，操作中有几点可能值得注意：(1)不
能因为质粒拷贝数低而过多的收集藻细胞，因为
藻细胞浓度太高，会使碱裂解液与藻细胞不能充
分接触，从而导致细胞破裂不彻底。此外，细
胞浓度过高，细胞裂解时产生的蛋白质、染色体
和细胞碎片的量也相应增多，形成的沉淀也易带
走质粒 DNA，从而造成损失。(2)由于染色体 DNA
呈线形且链较长，因此，在采用 S D S 碱裂解法
提取质粒 D N A 时，在加入溶液Ⅱ后，时间不能
过长，因为在这样的碱性条件下基因组 DNA 片段
会慢慢断裂。另外，动作也必须轻柔，否则基
因组 DNA 也会断裂，小片段的基因组 DNA 就不
容易与质粒DNA 分离开。(3)由于加入溶液Ⅱ后不
能剧烈摇动管内物质，所以在加入含溶菌酶的溶
液Ⅰ温育结束后，先混匀管内物质，以免管底沉
淀下来的藻细胞不能很好地与随后加入的溶液Ⅱ充
分反应，从而降低提取得率。
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