全 文 ：收稿日期:2013-09-17; 修订日期:2014-04-21
基金项目:山东省自然科学基金资助项目( No． ZＲ2010HQ054) ;
农业部橡胶树生物学重点开放实验室 /省部共建国家重点实验
室培育基地 －海南省热带作物栽培生理学重点实验室开放课
题基金项目资助( No． KLOF1106) ;
山东省高等学校青年骨干教师国内访问学者项目资助
作者简介:姚庆收( 1978-) ，男( 汉族) ，山东莒县人，滨州医学院药学院副
教授，硕士学位，主要从事中草药生物技术研究工作．
发根农杆菌介导的垂序商陆遗传转化体系的
建立及毛状根株系生物量分析
姚庆收，单长民，武玉永，于 敏，逄高燕
(滨州医学院药学院，山东 烟台 264003)
摘要:目的 建立发根农杆菌介导的垂序商陆遗传转化体系及毛状根株系生物量分析，为利用基因工程技术开发商陆奠
定研究基础。方法 活化发根农杆菌 Ｒ1601，利用其不同浓度的菌液对垂序商陆的叶片和茎段进行转化，利用 PCＲ 技术
鉴定毛状根;随机选取毛状根培养，鉴别不同株系间的生物量差异。结果 垂序商陆对发根农杆菌 Ｒ1601 侵染敏感，4 个
浓度都能高效诱导垂序商陆形成毛状根，其中 A600 为 1． 0 时，茎段和叶片的遗传转化效率都能达到 100% ; PCＲ 鉴定表
明毛状根中已经整合进了 T － DNA序列;不同毛状根株系生物量分析表明毛状根株系生物量呈极显著差异。结论 建立
了发根农杆菌 Ｒ1601 介导的垂序商陆的高效遗传转化体系，不同毛状根株系间生物量存在极显著差异。
关键词:发根农杆菌; Ｒi质粒; 垂序商陆; 毛状根; 遗传转化
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 08． 081
中图分类号:ＲS567 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2014) 08-1991-03
Establishment of Phytolacca Americana L． Genetic Transformation System by Agrobacte-
rium Ｒhizogenes and Analysis of Hairy Ｒoot Strains Biomass
YAO Qing-shou，SHAN Chang-min，WU Yu-yong，YU Min，PANG Gao-yan
( Department of pharmacy，Binzhou Medical College，Yantai 264003，China)
Abstract: Objective To establish the genetic transformation system of Phytolacca americana L． by Agrobacterium rhizogenes
mediated and analysis of hairy root strains biomass for the base of Phytolacca americana L． research using genetic engineering
technology．Methods Activated Agrobacterium rhizogenes Ｒ1601，transforming leaves and stems of Phytolacca americana L． by u-
sing different concentrations of Agrobacterium rhizogenes Ｒ1601; Hairy roots identified by PCＲ; randomly selected hairy roots to
culture，identified the biomass differences of different strains． Ｒesults Phytolacca americana L． is sensitive by Agrobacterium rhi-
zogenes Ｒ1601 infected; Four concentrations can induce hairy roots of Phytolacca americana L． highly efficient，the genetic trans-
formation efficiency of stems and leaves can reach 100 % if A600 is 1． 0; PCＲ identification showed the T － DNA sequences had
integrated into the hairy roots of Phytolacca americana L． ; The biomass analysis showed the biomass of different hairy root strains
was significantly different． Conclusion The genetic transformation system highly efficient of Phytolacca americana L． by Agrobac-
terium rhizogenes has been established，the biomass of different hairy root strains was significantly different．
Key words: Agrobacterium rhizogenes; Ｒi plasmid; Phytolacca americana L; Gairy roots; Genetic transformation
中药商陆是商陆属植物商陆 Phytolacca acinosa Ｒoxb．和垂序
商陆 Phytolacca americana L．的干燥根，商陆味苦性寒，有毒。归
肺、脾、肾、大肠经。功能逐水消肿，通利二便，解毒散结，为历版
《中国药典》收载品种［1，2］。现代药理研究发现，商陆具有多重药
用功效，临床主要用于治疗血小板减少性紫癜、肾水肿、急慢性肾
炎和银屑病等［3］。利用发根农杆菌诱导药用植物产生毛状根，
进行离体培养，是药用植物资源可持续发展的有效途径之
一［4，5］。本研究用发根农杆菌 Ｒ1601 菌株转化垂序商陆不同外
植体产生毛状根，并探究不同毛状根株系间生物量的差异，以期
为利用生物技术提高垂序商陆次生物质的含量或次生物质的转
化奠定研究基础。
1 材料
1． 1 商陆 垂序商陆嫩叶和茎段采摘于滨州医学院百草园。
1． 2 菌种 发根农杆菌 Agrobacterium rhizogenesＲ1601，由滨州医
学院基因工程教研室保存。
1． 3 试剂 主要试剂为烟酸、烟酸硫胺素、肌醇、萘乙酸、甘氨酸、
烟酸吡哆醇、氯仿等，均购于烟台华迅化学药品有限公司，均为国
产分析纯级;TaqDNA 聚合酶、dNTPs 和引物等购自上海生工生
物工程有限公司。
2 方法
2． 1 发根农杆菌 Ｒ1601 的活化 将发根农杆菌菌株 Ｒ 1601 接种
于 YEB 固体培养基、挑取单菌落 27 ℃活化 3 次，然后转至 YEB
液体培养基(培养基中含 200 mg /L 硫酸卡那霉素) ，避光 27 ℃，
180 r /min 振荡培养，测定菌液 A600吸光值，选取 0． 5，1． 0，1． 5 和
2． 0 四个浓度，对外植体进行侵染。
2． 2 垂序商陆外植体的无菌处理 用剪刀剪取幼嫩的垂序商陆
叶片和茎段，自来水流水冲洗 30 min，再用 4%的 NaClO浸泡 5 ～
10 min，然后于超净工作台上，用无菌水清洗 3 ～ 5 次，备用。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 8 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 8 期
2． 3 外植体的转化 无菌条件下，将叶片切成 0． 5 cm的小片，将
茎段切成 1． 5 cm 左右的块段，并在外植体上面轻轻划上 3 或 4
道伤口，置于不同 A600的菌液中，实验操作如下:处理好的外植体
和活化菌液在超净工作台中混匀 3 ～ 5 min ，取出外植体，置于
MS 培养基上共培养，2 ～ 3 d后，转移于含 100 mg /L 头孢克肟钠
的 MS 培养基上，根据发根农杆菌的生长情况，在MS 培养基上和
含 100 mg /L头孢克肟钠的 MS 培养基上之间转换约 2 ～ 3 次，直
到除去发根农杆菌，转移到 MS培养基上诱导分化毛状根。除不
与发根农杆菌共培养外，按上述操作进行做对照。
2． 4 垂序商陆毛状根的继代培养 随机选取诱导的垂序商陆毛
状根，截取 2 cm以上，移到新的 MS培养基上，进行继代培养，每
瓶加入 80 ml MS培养基(培养瓶为上海稼丰园艺用品有限公司
的 ZP16 － 340 广口瓶)。
2． 5 遗传转化率的统计 以共培养外植体个数为统计单位，诱导
出毛状根的外植体占总的共培养的外植体的比例为遗传转化率
(污染的外植体不统计在内)。即:诱导率 =诱导出毛状根的外
植体数 /总的共培养的外植体数 × 100%。
2． 6 垂序商陆毛状根的 PCＲ鉴定 用 CTAB 法提取垂序商陆毛
状根的 DNA和商陆叶片的 DNA;根据 Slightom等［6］发表的 Ｒi质
粒 DNA 序列，设计扩增引物为:引物 20131(TTACTGCAGCAG-
GCTTCATG)和引物 20132(GGCTTTCCCGACCAGAGACT) ，预计
扩增 DNA片段为 865bp;根据姚庆收等的 PCＲ 反应体系和程序
进行毛状根遗传转化鉴定［7］。
2． 7 垂序商陆毛状根的生物量测定及分析 随机各选取 3 株分
别由垂序商陆叶片和茎段诱导得到的毛状根株系(命名为 strain1
－ 6) ，进行继代培养，分批培养后，每隔 1 周进行一次生物量(生
物量 =收获量 －接种量)的测定，先取出培养的毛状根，去掉毛
状根团块中所含的 MS 培养基，用分析天平称鲜重，分析不同毛
状根株系的生长曲线;选取培养 6 周的不同毛状根株系的生物量
进行统计分析(SAS8． 1 方差分析)。
3 结果
3． 1 垂序商陆毛状根的诱导及外部形态特征
3． 1． 1 垂序商陆叶片毛状根的诱导及外部形态特征 本实验选
取垂序商陆叶片为外植体，利用 4 个浓度梯度的发根农杆菌
Ｒ1601 侵染叶片，在此实验条件下，不同浓度的发根农杆菌
Ｒ1601 对垂序商陆叶片的侵染能力略有差异，当发根农杆菌
A600为 0． 5 和 2． 0 时，诱导效果无明显差异，诱导率达到 80%以
上。但当发根农杆菌 A600为 2． 0 时，相同的除菌条件，难以清除
发根农杆菌，必须加大头孢噻肟钠的浓度。当发根农杆菌 A600为
1． 0 和 1． 5 时，遗传转化效率都能达到 100%，且发根农杆菌易于
清除。垂序商陆叶片被侵染后，毛状根的形成较快，1 周左右侵
染的叶片可以看到有白色的新生根状物出现，大约 2 周左右能观
察到的在垂序商陆叶片伤口部位出现的白色的根，且根的外形成
绒毛状态。转化成功的叶片上生根的多少不一致，最多的多达
10 条根以上，毛状根细长，分支较少，没有生长在培养基内的毛
状根细长且外覆绒毛状细微的根，肉眼难以分辨(如图 1)。
取 2cm以上的垂序商陆毛状根进行继代培养，1 周后毛状根
就明显变长，没有生长在培养基内的毛状根仍然细长且外覆绒毛
状细微的根出现很多细小的分支，培养基内的根，细长，分支少，
但没有被覆绒毛状细微的根，成光滑的特点(如图 2)。在无激素
的培养基上生长迅速，并具有无向地性特点。随着培养时间的延
长，毛状根生长愈发旺盛，当耗尽培养基中的营养成分后才会停
止生长，逐渐枯萎(如图 3 ～ 4)。
图 1 垂序商陆叶片诱导的毛状根
图 2 继代培养 1 周的垂序商陆叶片毛状根
图 3 经过 6 周以上时间继代培养的垂序商陆叶片毛状根(侧面观)
图 4 经过 6 周以上时间继代培养的垂序商陆叶片毛状根(正面观)
3． 1． 2 垂序商陆茎段毛状根的诱导及外部形态特征 在相同的
侵染条件下，茎段与叶片得到了相似的实验现象。诱导的毛状根
的外部形态特点与叶片诱导得到的一样。但用茎段作为外植体，
诱导得到的毛状根都从茎段的两端切口处生长。且四个侵染浓
度梯度下，也都能高效诱导得到毛状根(如图 5)。
图 5 垂序商陆茎段诱导的毛状根
没有感染农杆菌的垂序商陆叶片和茎段对照组，都在切口处
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时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 8 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 8
仅有少量愈伤组织形成，不产生毛状根。
3． 2 垂序商陆毛状根遗传转化率的统计 以共培养外植体个数
为统计单位，诱导出毛状根的外植体占总的共培养的外植体的比
例为遗传转化率(污染的外植体不统计在内) ，分别对垂序商陆
的叶片和茎段的诱导率进行了换算。具体数据如表 1 ～ 2。
表 1 不同发根农杆菌 Ｒ1601 浓度下垂序商陆叶片毛状根的诱导率
发根农杆菌 Ｒ1601(A600) 生根叶片个数 接种叶片个数 诱导率(%)
0． 5 71 79 89． 9
1． 0 86 86 100
1． 5 80 80 100
2． 0 62 75 82． 7
从表 1 可以看出，实验选取的 4 个浓度都能以垂序商陆叶片
为外植体高效的诱导出毛状根，且最高诱导率能够达到 100%。
表 2 不同发根农杆菌 Ｒ1601 浓度下垂序商陆茎段毛状根的诱导率
发根农杆菌 Ｒ1601(A600) 生根茎段个数 接种茎段个数 诱导率(%)
0． 5 48 52 92． 3
1． 0 46 46 100． 0
1． 5 57 60 95． 0
2． 0 40 43 93． 0
从统计结果可以看出，实验选取的四个浓度都能以垂序商陆
茎段为外植体高效的诱导出毛状根，且最高诱导率能够达到
100%。
3． 3 垂序商陆毛状根的 PCＲ 检测 经过 PCＲ 扩增后，得到如
图 6所示的实验结果。
图 6 垂序商陆毛状根的 PCＲ检测
第 1 ～ 2 泳道为 2 株垂序商陆叶片毛状根 DNA的 PCＲ结果，
第 3 ～ 4 泳道为 2 株垂序商陆茎段毛状根 DNA的 PCＲ结果，第 5
泳道为阴性对照，第 6 泳道为垂序商陆叶片 DNA 的 PCＲ 结果，
第 0 和 7 泳道为同一 Marker。
本实验根据 rolB基因设计的引物来扩增 rolB基因的部分序
列，其扩增产物共计 865bp，由电泳图片可知，发根农杆菌 Ｒ1601
感染垂序商陆之后，其 T － DNA序列已经整合进垂序商陆基因组
中，所诱导出的根为毛状根，而垂序商陆基因组内不含有该特异
DNA片段。
3． 4 垂序商陆毛状根的生物量测定 对培养的 6 个商陆毛状根
株系每隔 1 周进行一次生物量的测定，绘制生长曲线图如图 7。
结果说明，在本实验培养条件下，毛状根的生物量不断积累，
第 3 ～ 5 周是生物量积累的主要时期，不同毛状根株系间生长有
明显差异。
3． 5 不同毛状根株系间生物量分析 选取培养 6 周的不同株系
间毛状根生物量，利用 SAS8． 1 统计软件对不同株系间的生物量
进行方差分析，结果如表 3 所示，说明不同毛状根株系间生物量
差异极显著。
图 7 垂序商陆毛状根生长曲线图
表 3 不同垂序商陆毛状根株系生物量的分析 g
株系
株系毛状根生物量
(Alpha = 0． 05)
株系毛状根生物量
(Alpha = 0． 01)
Strain 1 11． 67c 11． 67C
Strain 2 15． 31b 15． 31B
Strain 3 8． 32d 8． 32D
Strain 4 12． 49c 12． 49C
Strain 5 15． 56b 15． 56D
Strain 6 17． 49a 17． 49A
表中数据后带有相同大写字母表示在 0． 05 /0． 0l水平差异不显著，带有不同大
写字母表示在 0． 05 /0． 01 水平差异显著
4 讨论
在不同的植物中，以不同部位作为外植体成功获得毛状根的
试验均有报道，而对于同一植物，不同外植体经侵染产生毛状根
的能力往往不同［8］。本实验选取幼嫩的垂序商陆叶片和茎段进
行侵染，显示两种外植体对发根农杆菌 Ｒ1601 的反应能力相似，
且获得了高效的诱导，表明垂序商陆是一种容易被发根农杆菌
Ｒ1601侵染转化的植物。发根农杆菌的生长状态和浓度对毛状
根的诱导有很大影响［9，10］，本实验室以往的研究也表明用于侵染
的发根农杆菌没有活化会对转化效率产生影响，菌液浓度过高，
会致使与外植体共培养时，增加除菌难度;同时，侵染时生长快的
发根农杆菌往往附着在外植体上，使外植体褐化甚至死亡。发根
农杆菌 Ｒ1601 侵染垂序商陆时，也显示了相似的实验结果，说明
对不同植物需要筛选不同的菌液浓度。
由于发根农杆菌侵染植物细胞时，Ｒi 质粒上的 T － DNA 片
段随机整合到植物基因组中，1 个毛状根株系起源于 1 个细胞，
诱导的毛状根其生长速度和次生代谢物含量也有差异［10］。因
此，建立高效、优质的毛状根株系具有重要的意义。毛状根培养
系统不但生长迅速、次生代谢物质合成能力强，而且生产能力稳
定，利于天然药物的开发利用［4］。今后将进一步探究垂序商陆
毛状根中主要化学物质的种类及含量，并筛选兼顾生物量和化学
物质含量高的垂序商陆毛状根株系，这些研究将为利用生物技术
研究中药商陆奠定基础。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 8 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 8 期
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收稿日期:2013-09-06; 修订日期:2014-04-06
基金项目:国家科技惠民计划专项项目( No． 2013GS510102) ;四川省“高等教育质量工程”建设项目( No． 196136)
作者简介:林秋霞( 1988-) ，女( 汉族) ，四川绵阳人，成都中医药大学硕士研究生，学士学位，主要从事中药品种、质量及资源研究工作．
* 通讯作者简介:李 敏( 1962-) ，女( 汉族) ，四川成都人，成都中医药大学教授，博士研究生导师，学士学位，主要从事中药品种、质量及资源研究工
作．
植物生长调节剂对川麦冬生长发育影响的研究
林秋霞，李 敏* ，罗远鸿，黄 潇，杨冰月
(成都中医药大学 中药材标准化教育部重点实验室，
中药资源系统研究与开发利用国家重点实验室，四川 成都 611137)
摘要:目的 通过研究植物生长调节对药用植物川麦冬生长发育的影响，为川麦冬的规范化栽培提供理论依据。方法 根
据植物生长调节剂多效唑( PP333 ) 、膨大素( CPPU) 的施用量和施用方式设计随机区组试验，在果期处理川麦冬，考察其对
川麦冬植株的株高、冠幅、分蘖数等农艺性状以及产量的影响。结果 研究表明植物生长调节剂在一定程度上改变了川
麦冬植株的农艺性状，且随着植物生长调节剂种类、施用量和施用方式的不同而影响不同;多效唑、膨大素对川麦冬块根
的长度、直径及百粒重均有显著的提升作用;多效唑、膨大素能显著提高川麦冬产量，增产效率与剂量和施用方式有一定
关系，其中多效唑与膨大素分段合用时效果最佳，增产可高达 276． 26%。结论 植物生长调节剂对川麦冬生长发育有一
定的影响，对其产量有显著促进作用，但关于植物生长调节剂在川麦冬植株和土壤中的残留以及对川麦冬药材质量的影
响有待深入研究。
关键词:植物生长调节剂; 川麦冬; 生长发育; 产量
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 08． 082
中图分类号:S567 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2014) 08-1994-02
A preliminary study on the effect of plant growth regulator on Growth and Development
of Ophiopogon japonicus
LIN Qiu-xia，LI Min* ，LUO Yuan-hong，HUANG Xiao，YANG Bing-yue
( College of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，The Ministry of Education Key Labo-
ratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Ｒe-
search，Development and Utilization of Chinese Medicine Ｒesources，Chengdu 611137，China)
Abstract: Objective We studied the influence of plant growth regulator on medicinal Ophiopogon japonicus growth to provide a
theoretical basis for Ophiopogon japonicus standardized planting． Methods We designed randomized block experiments based on
application rate and mode of administration of two typical plant growth regulator PP333 and CPPU，and we handled the medicinal
Ophiopogon japonicus in its fruit period to measure its agronomic traits as plant height，crown width，tiller number and its yield．
Ｒesults Its suggested that the plant growth regulator changed the medicinal Ophiopogon japonicus agronomic traits to some extent，
and the influence varies on type of plant growth regulator，application rate and mode of administration; the application of PP333
and CPPU enhanced the root length，root diameter and kernel weight; the application of PP333 and CPPU significantly increased
yield of medicinal Ophiopogon japonicus; tits suggested that the increasing efficiency is related to application rate and mode of ad-
ministration，the combined application of PP333 and CPPU arrives at the best prime segment，an increase of up to 276． 26 percent
has been reached when used properly． Conclusion It＇s proved that plant growth regulator has influence on plant growth and devel-
opment，and it has significant promotion to its yield． However，the soil residues of plant growth regulators in Ophiopogon japonicus
plants as well as quality of medicinal Ophiopogon japonicus is worthy of further study．
Key words: Plant growth regulator; Ophiopogon japonicus; Growth and development; Production
麦冬为百合科沿阶草属植物麦冬 Ophiopogon japonicus(L． f) Ker － Gawl．的干燥块根，具有滋阴润肺、益胃生津的功效［1］。麦
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时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 8 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 8