全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 6期，2007年 12月1040
NADPH氧化酶参与水杨酸诱导的蚕豆气孔关闭过程
何金环 1，李存法 1，王朋涛 2，宋纯鹏 2,*
1郑州牧业工程高等专科学校生物工程系，郑州 450011；2河南大学生命科学学院，河南开封 475001
提要：水杨酸(SA)可以浓度依赖的方式诱导蚕豆叶片的气孔关闭，1~1 000 µmol·L-1 SA所诱导的气孔关闭可以再开放，
而 10-2 mol·L-1的 SA导致的气孔关闭则否。质膜 NADPH氧化酶抑制剂二亚苯基碘(DPI)可削弱 SA作用的 45%~60%。表
明SA诱导的气孔关闭可能与H2O2的产生有关。以H2O2荧光探针H2DCFDA结合显微注射技术直接检测保卫细胞内产生
H2O2的结果显示，100 µmol·L-1 SA可引起保卫细胞内荧光素(DCF)荧光快速增强。在DPI存在的情况下，经 SA处理的
保卫细胞，仅在其叶绿体部位产生H2O2，而质膜附近的DCF荧光增强则受到抑制。表明叶绿体可能是保卫细胞内产生
H2O2的主要部位，质膜 NADPH氧化酶也可能参与 SA诱导H2O2的产生。
关键词：蚕豆；气孔；水杨酸；NADPH氧化酶；显微注射
Involvement of NADPH Oxidase in Stomatal Closure Induced by Salicylic Acid
in Vicia faba L.
HE Jin-Huan1, LI Cun-Fa1, WANG Peng-Tao2, SONG Chun-Peng2,*
1Department of Bioengineering, Zhengzhou College of Animal Husbandry Engineering, Zhengzhou 450011, China; 2College of Life
Sciences, Henan University, Kaifeng, Henan 475001, China
Abstract: Salicylic acid (SA) can induce stomatal closure with a concentration-dependent manner, the closed
stomata can open again when the concentration of SA is between 1–1 000 µmol·L-1, but when the concentration
of SA is 0.01 mol·L-1, the change of closed stomata cannot happen. DPI 10 µmol·L-1 weakened the effect of SA
on stomatal apertures by 45%–60%, which indicated that the generation of H2O2 might be involved in the
stomatal closure induced by SA. We directly examined the production of H2O2 by microinjection based on
H2DCFDA. SA 100 µmol·L-1 by applied externally or microinjection could induce rapid increasing in fluores-
cence of DCF in guard cells. In the presence of DPI, the guard cells treated with SA 100 µmol·L-1 showed
increase in DCF fluorescence only in the regions of chloroplasts, but the production of H2O2 was inhibited in the
regions of plasma membrane. These results suggest that the chloroplasts in guard cells might be the main
source of H2O2 production, meanwhile, plasma membrane NADPH oxidase may also contribute to the H2O2
generation in the guard cells, when treated with SA.
Key words: Vicia faba; stomata; salicylic acid; NADPH oxidase; microinjection
收稿 2007-08-06 修定 2007-09-16
资助 国家自然科学基金(39 8 70 3 7 2)。
* 通讯作者(E-mail：songcp@henu.edu.cn；Tel：0378-
2 8 5 5 0 1 0 )。
水杨酸(salicylic acid，SA)在植物体内有多种
生理调节作用，如抑制乙烯的生物合成，使膜通
透性改变，促进离子吸收，增强植物的抗病性。
有报道认为某些病原菌只能通过开放的气孔才能侵
入植物体内，所以SA诱导气孔关闭有利于提高植
物对某些病原菌的抗性(Agrios 1997)。因此，SA
诱导气孔关闭的信号转导及其在植物抗病性中的作
用机制成了近年来的研究热点。
有实验表明，外源 SA可诱发多种植物积累
病程相关蛋白(pathogenesis-related protein，PR)，
并产生抗病性(Klessig和Malamy 1994)。还有实验
表明，施用外源H2O2也能诱导烟草中 PR积累蛋
白，只是其诱导效应低于 SA，而认为 SA的作用
机制至少部分与H2O2有关。植物细胞中产生活性
氧的途径很多，但是有关植物氧化猝发过程中活
性氧形成的分子机制及其作用位点仍有争议，多
数报道(孙玉和陈珈1997)认为其主要发生于胞外，
由质膜氧化还原系统产生。质膜电子传递系统或
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质膜氧化还原系统(pl a sma membra ne r edox
system，PMRS)普遍存在于原核生物及所有动植
物体内(Rubinstein和 Luster 1993)，产生 O2－· 的
NADPH氧化酶是 PMRS的一个组分。Henderson
和 Chappel (1996)的研究表明，NADPH氧化酶作
为哺乳动物细胞中的一种嗜中性氧化酶在有氧代谢
的呼吸猝发(respiratory burst)中起作用。现已查
明，植物细胞中也有类似于动物细胞的嗜中性
NADPH氧化酶，而且此NADPH氧化酶在氧化猝
发(oxidative burst，OXB)中的作用已从一些抑制
剂的添加实验中得到证实。如作为NADPH氧化酶
的自杀性底物抑制剂二亚苯基碘( di phenyl ene
iodonium，DPI)可阻止一些由真菌刺激产生的
OXB，也可抑制事先加入NADPH的玫瑰细胞中线
粒体膜上H2O2的产生(Auh和Murphy 1995)。Doke
和Miura (1995)在研究马铃薯块茎切片过敏反应时
发现，激发子可激活块茎细胞膜上的NADPH氧化酶
并迅速产生O2－· 。O2－· 跨膜扩散性较小，最有可能
存在于膜外，一般认为H2O2是OXB的主要积累产
物。玫瑰细胞用 N,N- 二乙基二巯基氨基甲酸酯
(SOD抑制剂)处理后，H2O2的产生即停止，表明
O2－· 在膜外产生，其被 SOD迅速歧化为H2O2后，
通过质膜在胞内(或胞间)运输( A l l a n 和 F l uh r
1997)。本文以蚕豆气孔为材料，用表皮条生物
分析和显微注射技术探讨NADPH氧化酶参与 SA
诱导气孔关闭的过程。
材料与方法
蚕豆(Vicia faba L.)种子先用 75%的乙醇表面
消毒 5 min，在温室(20~25 ℃)下催芽 3~4 d，播种
于培养土(营养土:蛭石为 1:1)中。蚕豆生长的光 /暗
周期为 14 h/10 h，光照强度为 0.2~0.3 mmol·m-2·s-1，
昼夜温差分别为 25 ℃±2 ℃和 20 ℃±2 ℃，相对
湿度在 70% 左右，生长期间未受到任何逆境因
素。
取3~4周龄苗顶端第1~2对完全展开的叶片，
用蒸馏水洗净，撕取下表皮，洗净叶肉细胞后，
切成约 5 mm长的表皮条，置于基本缓冲液(KCl
50 mmol·L-1、Mes 10 mmol·L-1，pH 6.1)中。在
促进气孔张开的条件下培养 3 h，使气孔完全张
开，然后从缓冲液中取出表皮条，放入不同的处
理液处理。实验记录有 2种：一种是处理前观察
并记录一次气孔开度，处理 2 h后观察并记录处
理后的气孔开度，之后表皮条漂洗后置于新鲜的
基本缓冲液中，2 h后观察并记录气孔开度恢复情
况；另一种是在处理过程中每隔一定的时间间隔
观察并记录一次气孔开度，连续记录 5次。均在
10×25倍倒置显微镜下用测微尺测定。每次观察
3个表皮条，随机选取 5个视野测定记录 50个气
孔的开度。每个实验重复 3~5次，统计其平均值
和平行实验间的方差。
测定 SA诱导胞内H2O2产生时，预先将 2 ,7-
二氯二氢荧光素乙酰乙酸盐(2,7-dichlorofluorescin
diacetate，H2DCFDA)以 50 mmol·L-1的二甲亚砜
(DMSO)配成母液，分装冷冻保存。负载时撕取
蚕豆叶片下表皮并切成约 10 mm长的表皮条，培
养在 5 mL负载缓冲液(KCl 50 mmol·L-1、Mes 10
mmol·L-1，pH 7.2)中，然后加入 5 µL的H2DCFDA
二甲亚砜母液混匀至终浓度为 50 mmol·L-1，室温
(25 ℃±2 ℃)下避光保温 10~15 min。将已引入
H2DCFDA的表皮条用新鲜的负载缓冲液漂洗 2
次，以洗去细胞表层多余的探针，然后用 2个附
有双面胶的玻璃片将表皮条两端固定在盛有0.5 mL
缓冲液的塑料培养皿底部，置于倒置显微镜
(Nikon-TE300)载物台上(物镜 40×0.6 Plan Fluor)。
用显微拉制仪(PC- 10，Na r ish ige Scient i f ic
Instruments)将 1 mm×90 mm有芯玻璃管(GD-1，
Narishige Scientific Instruments)拉成尖端直径<1 µm
的显微注射针，然后用负压前端加样法(front-fill-
ing of pipette)将待注射的试剂吸入显微注射针的前
端。显微注射在显微操作系统下进行(1 88N E，
Narishige Scientific Instruments) [参照Ma等(1999)
的方法]。为确保细胞活性和实验结果的可靠性，
每次实验后用荧光素二乙酸酯(fluorescein diacetate，
FDA)对实验细胞进行染色，发出绿色荧光的为有
活性细胞。
结果与讨论
1 不同浓度 SA对气孔开度的影响
为找到一个既可诱导气孔关闭又不会对气孔
保卫细胞造成伤害，而且在此浓度下植物受到病
原菌感染时其体内的SA仍处于正常生理浓度范围
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内的 SA浓度。我们用不同浓度 SA处理蚕豆气孔
保卫细胞并用荧光素二乙酸酯(FDA)检测处理后细
胞活性的结果(图 1)表明，SA可以浓度依赖的方
式诱导气孔关闭，并且随着 SA浓度的升高，其
诱导气孔关闭的作用越明显。浓度在 1×10-6至
0.001 mol·L-1的 SA所诱导的气孔关闭具有可逆
性，而当浓度达到 0.01 mol·L-1时的 SA所诱导的
气孔关闭则不可逆。检测细胞活性的 FDA表明，
当 SA浓度在 10-6 mol·L-1至 10-3 mol·L-1时，保卫
细胞可保持良好的活性，而当 S A 浓度为 0 . 0 1
mol·L-1时，保卫细胞的活性即丧失，表明 SA在
此浓度时诱导的气孔关闭可能是其伤害细胞的结
果。本文以下的实验均采用 100 µmol·L-1这一 SA
浓度。
促进质膜 NADPH氧化酶产生 H2O2 (Shirasu等
1997)。
3 显微注射 SA诱导保卫细胞H2O2的产生
如图 3所示，左侧保卫细胞经显微注射引入
100 µmol·L-1 SA后，其DCF荧光明显增强，而
另一侧未注射 SA的保卫细胞荧光产生明显滞后，
而且十分微弱，这可能是一侧注入保卫细胞中的
SA有一部分扩散入另一侧未注射 SA的细胞中，
并在一定程度可能诱导H2O2的产生，或者是由于
前者保卫细胞中产生的H2O2扩散进入后者的细胞
中，导致部分H2DCF的氧化产生一定的荧光，也
可能是显微注射 SA后上述 2种情况同时存在的。
从图 3还可以看到，在 SA处理后，保卫细
胞内DCF荧光增强首先表现在叶绿体部位，其他
胞质区域如质膜附近和非叶绿体存在的细胞质区域
的荧光上升稍有滞后。由于保卫细胞与其他表皮
细胞不同，它含有叶绿体，可进行光反应，释
放O2并产生化学能ATP和NADPH，作为产生活
性氧的驱动力。
4 DPI预处理对SA诱导保卫细胞H2O2产生的影响
图2和图3显示的质膜NADPH氧化酶可能是
保卫细胞中除叶绿体外H2O2的另一重要来源。从
图 4可以看出，SA处理前预先加入 10 µmol·L-1的
DPI可明显抑制质膜部位荧光增强。这可能是DPI
抑制了质膜NADPH氧化酶，从而阻止质膜上H2O2
产生的结果，但叶绿体中 H2O2的产生几乎不受
图 1 不同浓度 SA对蚕豆气孔开度的影响
Fig.1 Effects of different concentrations of SA
on stomatal apertures of V. faba
图 2 DPI对水杨酸诱导蚕豆气孔关闭的影响
Fig.2 Effect of DPI on stomatal closure
induced by SA of V. faba
2 DPI对水杨酸诱导气孔关闭的影响
图 2显示 10 µmol·L-1的DPI与 100 µmol·L-1的
SA共同处理时，DPI部分削弱 SA诱导的气孔关
闭的作用，处理后 30~195 min DPI的削弱作用达
45%~60%，而DPI单独处理时气孔开度仅比未做
DPI处理的增加 2%~5%，这暗示DPI削弱 SA诱
导的气孔关闭作用可能是由于DPI抑制了SA刺激
的质膜NADPH氧化酶产生H2O2，而不是由于DPI
促进气孔开度增加与SA诱导气孔关闭作用的简单
叠加。同时也暗示保卫细胞质膜NADPH氧化酶在
正常生理状态下活性非常低，在SA处理时此酶也
可能参与SA诱导的H2O2产生。也有人认为SA可
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图 3 显微注射 SA诱导蚕豆叶片保卫细胞中H2O2的产生
Fig.3 Production of H2O2 induced by microinjection of SA into guard cells of V. faba
　　a 0表示显微注射 100 µmol·L-1 SA入保卫细胞； a、b、c、d、e分别表示同一保卫细胞在注射 100 µmo·L-1 SA后 10、20、
1 00、2 0 0 和 3 0 0 s 的荧光强度。e的彩色图标表示荧光强度(0 ~ 2 5 5 ) ；标尺：1 0 µm。
图 4 DPI预处理对 SA诱导蚕豆保卫细胞H2O2产生的影响
Fig.4 Effect of DPI pretreatment on the production of H2O2 induced by SA in guard cells of V. faba
　　a 表示已保温的荧光探针 H2DCFDA和 10 µmol·L-1 DPI 预处理、未加入 100 µmol·L-1 SA的保卫细胞荧光强度； b、c、d、
e、f 分别显示同一保卫细胞在加入 1 0 0 µmol · L -1 SA 后 1 0、2 0、1 0 0、2 0 0、3 0 0 s 的荧光强度。f 的彩色图标表示荧光强度
(0 ~2 5 5 ) ；标尺：1 0 µm。
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DPI的影响，这进一步说明胞内叶绿体可能是 SA
诱导保卫细胞产生H2O2的主要来源。
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