全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 4期，2004 年 8 月 427
缺磷胁迫对甘蔗悬浮细胞磷素吸收特性和相关酶活性的影响
李红1,* 邝炎华2 彭新湘2
1华南师范大学生命科学学院, 广州 510631; 2华南农业大学生命科学学院, 广州 510642
提要 在初始磷浓度为 1.25 mmol·L-1 的 MS 培养基中，甘蔗悬浮细胞在继代后的 1 d 之内几乎将磷完全吸收。此后，细
胞在数天内仍能继续生长。缺磷细胞对磷的吸收动力学参数 Imax 增加，Km 减少。在培养过程中，缺磷细胞的无机磷含量
变化不大，但随着培养时间的延长，细胞酸性磷酸酶活性逐渐升高，且在培养的第 8 天，活性增加 4 倍。甘蔗悬浮细
胞中不仅有植酸酶的存在，且在培养的第 8 天，缺磷细胞植酸酶活性比不缺磷的增高 2.5 倍。
关键词 甘蔗；悬浮细胞；缺磷胁迫；磷素吸收；酸性磷酸酶和植酸酶
Effects of Phosphorus-deficiency on Phosphorus Uptake of Suspension-cultured
Cells and Relative Enzyme Activities of Sugarcane (Saccharum officinarum)
LI Hong1,*, KUANG Yan-Hua2, PENG Xin-Xiang2
1College of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631; 2 College of Life Science, South China Agricul-
tural University, Guangzhou 510642
Abstract During the exponential growth phase, exposed to normal P conditions(KH2PO4 initial concentration
1.25 mmol·L-1) , cells were able to consume all of the phosphorus in MS medium within 1 d. And cells could still
continuously grow after that. In comparison with the normal cells, Imax was increased whereas Km was decreased
in 0 P treated cells, which indicated that both the rates and the affinity to P increased. Acid phosphatase (APase)
and phytase activities were induced by P-deficiency. At 8 d after the treatment, APase and phytase activities in
the 0 P treated cells were 4 times and 2.5 times higher than the control, respectively.
Key words sugarcane; suspension-cultured cell; phosphorus deficiency; phosphorus uptake; acid phosphatase
and phytase
收稿 2003-12-01 修定 　 2004-03-29
资助　 广东省自然科学基金项目(980143)。
* E-mail: lilab@scnu.edu.cn，Tel：020-85211378
在整体植株、器官或组织水平上进行的磷动
力学吸收试验中，由于植物结构的复杂性常常导
致研究结果的准确性降低[1]。本文利用的悬浮细
胞均一性好，对磷胁迫的反应更为敏感和直接，
测得的磷吸收动力学性质可能更可靠。已知植物
吸收磷的能力通过磷的Imax(最大吸收速率)增加而
得以增强，但磷的Km (1/Km 为对磷吸收的近似亲
和力)则没有任何变化[2,3]。迄今，在植株水平上
研究磷吸收动力学的报道很多[4,5]，而从细胞水平
上进行研究的报道则很少[1,6]。另外，在植物代谢
中，酸性磷酸酶(acid phosphatase, APase)和植酸
酶(phytase)在植物对磷的吸收与利用中有重要作
用。作为专一性APase的植酸酶的相关研究[7,8]很
多，但取材多数仍集中为萌发的种子和花粉，植
物的其它组织器官中的植酸酶尚未受到重视，以
植物悬浮细胞进行此类问题研究的报道几乎是空
白。为此，本文在测定缺磷胁迫对细胞 APase 活
性影响的同时，还在检测植酸酶是否存在于甘蔗
悬浮细胞中的基础上，测定了缺磷胁迫对细胞植
酸酶活性的影响。
材料与方法
材料为甘蔗(Saccharum officinarum)品系
US66-56-9 (S. spontaneum hybrid)，是美国夏威夷
甘蔗品系US56-15-8(S. spontaneum)与L60-25(S.
spontaneum)的杂交后代，四倍体，染色体数目
96。取其心叶为接种材料。愈伤组织的诱导和悬
浮细胞的培养参考陈彪等[9]的方法。固体培养基
为 MS基本培养基 + 3 mg·L-1 2,4-D + 30 g·L-1蔗糖 +
0.5 g·L-1酪蛋白 + 50 mL·L-1椰子汁 + 6 g·L-1琼脂，
pH 5.8。愈伤组织的诱导在温度为25℃、黑暗中
进行，每隔 15~20 d 做 1 次继代培养。液体培养
基为 MS基本培养基 + 3 mg·L-1 2,4-D + 30 g·L-1蔗糖 +
0.5 g·L-1酪蛋白 + 50 mL·L-1椰子汁。每隔9 d继代
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1次，接种量约为2 g·L-1的细胞干重(即每瓶含35
mL 液体培养基，接种量约 0.7 g· 瓶-1 的细胞鲜
重)。悬浮培养条件为：温度25℃，摇床转速120
r·min-1。
磷水平有：0P(0 mmol·L-1)、1/4P(0.3125
mmol·L-1)和 1P(1.25 mmol·L-1)，以 KH2PO4 配制，
并用1 mol·L-1 的 KOH 调至 pH 5.8，抽滤灭菌后
加入已灭菌的液体培养基中，即为所需磷浓度的
培养液。缺磷胁迫处理是将处于对数生长期(第 6
天)的悬浮细胞转入缺磷和低磷的新鲜培养基中，
同时以全磷为对照。其余培养条件相同。
细胞的生长量以细胞干重表示。连续测定9 d，
每天各取 4~5 瓶不同处理的悬浮细胞，以重蒸水
充分洗涤，抽干，称鲜重后置于60℃烘箱中烘至
恒重，即为干重。
细胞无机磷和总磷的提取及含量测定按鲁如
坤[10]的方法，并作改进。磷的吸收动力学测定时,
培养基中无机磷含量按钼锑抗比色法[10]测定。
细胞对磷的吸收动力学测定参考Shimogawara
和Usuda[1]的方法。根据离子吸收动力学方程：V=
ImaxC/(Km+C)，以离子消耗试验测定对照和缺磷条
件下的甘蔗悬浮细胞对磷素吸收动力学参数 K m、
Imax(V 为细胞对磷的吸收速率；C为培养基中磷浓
度)。
APase的提取和活性测定参照McLachlan[11]的
方法。APase酶活力单位以27℃、pH 5.5条件下，
每1 min内 OD405 变化 1个单位的酶量为U，并用
mU·min-1·mg-1(蛋白)表示。
植酸酶提取和活性测定参照Gibson和Ullah[12]
的方法。其活性以 27℃、pH 5.5 的条件下，每
1 min内生成1 mmol Pi的酶量为1个单位，并用
mmol (Pi)·min-1·mg-1(蛋白)表示。试验所用试剂均
用双蒸水配制。
酶溶液蛋白质含量按Bradford[13]的方法，以
牛血清蛋白为标准蛋白质。
实验结果
1 缺磷胁迫对细胞生长量的影响
图1表明，缺磷(0P)和低磷(1/4P)处理的细胞
干重的变化趋势与未作磷处理的一致，均随培养
时间的延长而增加，但上升幅度由高到低的顺序
为：未作磷处理(1P)、1/4P 及 0P。
2 缺磷胁迫对细胞与培养基中无机磷含量和细胞
总磷含量的影响
在培养过程中，缺磷细胞的无机磷含量变化
平稳；低磷细胞迅速吸收培养基中的磷，第 1 天
最大，后随培养时间的延长而降低；未作磷处理
的培养基中无机磷含量一开始即急剧下降，第 2
天后基本上仍保持下降趋势，第 5 天后与缺磷和
低磷培养基中的无机磷含量几乎持平(图2)。低磷
培养基中无机磷含量在前2 d内快速下降，后保持
在(0.04±0.03)~(0.12±0.04) mmol·L-1范围内变化；
而缺磷的培养基中无机磷含量始终无多大变化(图
3)。全磷和低磷条件下的细胞总磷含量在培养的
第 1 天陡然上升至最高，后逐渐下降。第 1 天后
图2 缺磷胁迫对细胞无机磷含量的影响
Fig.2 Effect of phosphorus-deficiency on Pi content
of sugarcane cells
图3 缺磷胁迫对培养基中无机磷含量的影响
Fig.3 Effect of phosphorus-deficiency on Pi content
in the medium
图1 缺磷胁迫对细胞干重的影响
Fig.1 Effect of phosphorus-deficiency on dry weight
of suspension-cultured cell of sugarcane
植物生理学通讯 第 40 卷 第 4期，2004 年 8 月 429
未作磷处理的细胞总磷含量以较大幅度下降，缺
磷和低磷的细胞则较为平缓(图 4)。
3 缺磷对细胞磷吸收动力学特性的影响
在磷营养胁迫条件下，Imax 为细胞对磷的最
大吸收速率，Km 为米氏常数，1/Km 表示吸收系
统对磷的亲和力。根据未作磷处理的细胞和缺磷
细胞对磷素吸收的衰减曲线(depletion curve)绘制出
这两类细胞的磷吸收速率与磷浓度的关系图(图
5)，便可以判别两者对磷吸收动力学参数的差异
(表1)。结果是缺磷细胞对磷素吸收的动力学参数
Imax 增大，Km 减小，且分别是未作磷处理细胞的
1.44 倍和 62%。
4 缺磷胁迫对细胞APase和植酸酶活性的影响
随着培养时间的延长，缺磷细胞的APase 活
性逐渐升高，而未作磷处理的细胞则缓慢下降；
第 8 天，前者升至最高，后者则降到最低，前
者约是后者的4倍(图 6)。
缺磷细胞的植酸酶活性除了在第 2 天稍有降低
外，以后就随着培养时间的延长而逐渐升高；未
作磷处理的细胞中植酸酶活性随培养时间的延长而
逐渐下降；至第 8 天，前者升至最高，后者则
降到最低，前者约是后者的2.5 倍(图 7)。
讨　　论
前人的许多实验已经说明，培养基中无机磷
在迟滞期即被细胞快速吸收[2,14]。本文结果也证
明，在正常培养条件下，处于对数生长期的甘蔗
悬浮细胞生长旺盛，需磷量极大，而培养基中无
机磷含量很低，所以此时将细胞转入正常培养基
后，培养基中的无机磷即被迅速吸收，细胞几乎
在1 d之内将培养基中的磷消耗完。细胞将吸收的
无机磷不断用于细胞的生长和代谢，因而细胞无
机磷含量和总磷含量也随培养时间的延长而下降。
表1 缺磷胁迫对细胞Imax和Km的影响
Table1 Effect of phosphorus-deficiency on
Imax and Km of sugarcane cells
Imax /mmol·g-1 (FW)·min-1 Km /mmol·L-1
1P 0.079±0.008 24.44±1.68
0P 0.140±0.012 15.09±1.49
图7 缺磷胁迫对细胞植酸酶活性的影响
Fig.7 Effect of phosphorus-deficiency on phytase
activity of sugarcane cells
图5 缺磷细胞的磷吸收速率与磷浓度的关系
Fig.5 Relation between uptake velocity and phospho-
rus concentration of sugarcane cells under
phosphorus deficiency
图4 缺磷胁迫对细胞总磷含量的影响
Fig.4 Effect of phosphorus-deficiency on total P
content of sugarcane cells
图6 缺磷胁迫对细胞APase活性的影响
Fig.6 Effect of phosphorus-deficiency on APase
activity of sugarcane cells
植物生理学通讯 第 40 卷 第 4期，2004 年 8 月430
在缺磷和低磷条件下，由于培养基中提供的无机
磷浓度低，因而细胞只能利用自身原含有的磷和
通过有限的糖代谢为生长和其它代谢提供磷，从
而抑制细胞的正常生长和代谢。
不同植物种类或同一植物的不同基因型对营
养元素的吸收和利用能力存在差异。在不同的磷
供应条件下，植物并不是以某种固定的模式吸收
Pi。最常见的动力学吸收系统有两种：高亲合性
的Pi运转系统和低亲合性的Pi运转系统。缺磷胁
迫能诱导植物高亲和性(低Km )的磷转运系统和(或)
磷的最大吸收速率(Imax)的增加[15]。Shimogawara
和Usuda[1]报道，将烟草悬浮细胞由全磷培养基转
至缺磷培养基后，磷吸收的 Imax 增大 5 倍，而 Km
(Pi)不变，约为2.5 mmol·L-1。在缺磷条件下，长
春花(Catharanthus roseus)悬浮细胞[6]对磷吸收的
Imax 明显增加，而 Km 减少。本文结果表明，缺
磷胁迫的甘蔗悬浮细胞对磷的吸收动力学参数Imax
增加，而 Km 减少。这表明缺磷胁迫促进细胞对
磷的吸收速率增加和细胞对磷的亲和力增大，与
万美亮和邝炎华[16]的缺磷条件下甘蔗根系对磷的
吸收动力学参数Imax增加、而Km 减少的结果是一
致 的 。
APase 与植物磷营养状态之间有密切关系。
缺磷胁迫下，植物体内和外分泌性 APase 活性增
强，水解细胞内和胞外空间的磷脂释放磷，供缺
磷细胞利用[17]。万美亮和邝炎华[18]报道缺磷胁迫
诱导各基因型的甘蔗根系和叶片中APase活性明显
升高。本文结果也证实了这一点，即随着培养时
间的延长，缺磷胁迫的甘蔗悬浮细胞 APase 活性
升高，最大时是未作磷处理的 4 倍。
植酸酶广泛存在于植物中，是一种专一性的
APase，能催化植酸水解释放出无机磷[19]。种子
或花粉萌发时，植酸酶水解植酸，释放出无机
磷，供种子和花粉萌发的需要[20 ]。因此，一般
认为植酸是植物生长发育关键时期动用贮藏态磷的
主要手段[19]。尽管对植酸酶的研究很多，但研究
材料大多仍集中于萌发的种子和花粉。直到近年
来，植物根中植酸酶的酶学性质才得以确定[21,22]。
Li等[22]报道低磷条件下，16种作物根分泌的植酸
酶活性增加 10 倍；同一植物根分泌的植酸酶与
APase 的活性相平行；在有些作物中，植酸酶的
活性高于 APase 活性。本文中随着培养时间的延
长，缺磷胁迫诱导甘蔗悬浮细胞中植酸酶活性升
高也验证了这一结果。
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