全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 2期，2004 年 4 月226
收稿 2003-05-26 修定 　 2003-11-24
资助　 广东省自然科学基金项目(010118)。
* 通讯作者(E-mail:lsshsz@zsu.edu.cn, Tel:020-
84110797)。
一种提取荔枝胚中总RNA 的方法
张以顺1 向旭2 傅家瑞1 黄上志1,*
1 中山大学生命科学学院，广州 510275； 2 广东省农业科学院果树研究所，广州 510640
A Method for Extraction of Total RNA from Litchi Embryo
ZHANG Yi-Shun1, XIANG Xu2, FU Jia-Rui1, HUANG Shang-Zhi1,*
1Life Science School, Zhongshan University, Guangzhou 510275; 2Pomology Institute, Guangdong Academy of Agricultural
Science, Guangzhou 510640
提要 用改良的 Tris- 硼酸法和 3S 柱式细胞及组织总 RNA 抽提试剂盒 V2.0 提取 3 个荔枝品种胚中的总 RNA，经纯度和
甲醛变性胶分析，其 A260/A280 值在 1.91~2.02 之间，基本完整，未检出明显降解。
关键词 荔枝；总 RNA；胚；提取方法
植物组织中 RNA 常用的提取方法有胍法[1]、
苯酚法[2]和十六烷基溴化胺法[3]，但这些方法对
荔枝胚等富含多糖、多酚以及一些尚未确定的次
生代谢产物的植物组织来说，有一定的局限性。
虽然近年来也有成功地从芒果[4]、猕猴桃[5]、香
蕉[6]等果实中提取到高质量 RNA 的报道，但由于
不同植物组织的组成成分差异较大，对某种植物
能取得满意结果的 RNA 提取方法套用到其它植物
组织时，不一定就能取得较好的效果，荔枝便是
一个典型的例子。
荔枝属顽拗性种子的植物，其组织中含有大
量的多酚类物质。这些物质在 RNA 的提取过程中
容易被氧化而产生褐变，能有效去除酚类物质的
试剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)虽可在一定程度上防止
褐变，但也很难获得纯度高的 R N A 。因此，建
立一种简便的适合荔枝胚总 RNA 的提取方法，是
研究荔枝胚败育分子机制的关键，本文对 López
等[4]的方法进行改良，引入80%的乙醇 (pH 5.0)
对荔枝胚进行预处理，取得了满意的结果。另
外，我们还对一些植物 RNA 提取试剂盒进行了筛
选，用上海申能博彩生物科技有限公司生产的3S
柱式细胞及组织总RNA抽提试剂盒V2.0，提取荔
枝胚中总 R N A 的效果也较好。现将结果报道如
下。
材料与方法
1 材料
荔枝幼果取自广东省农业科学院果树研究所
大丰基地荔枝园，品种包括大核品种黑叶、焦核
品种妃子笑和桂味，均是七至九年生的正常挂果
果树。盛花期选择花量较大、花穗健壮的单株，
挂牌记录各花穗的雌花开放期，从谢花后20 d开
始，每隔 10 d 取幼果一批，置冰壶中带回实验
室，置于 - 2 0℃低温冰箱中保存备用。
2 试剂
3S 柱式细胞及组织总 RNA 抽提试剂盒V2.0
购自上海申能博彩生物科技有限公司，其余试剂
均为国产分析纯。
3 荔枝幼胚总RNA 的提取
3.1 改良的Tris-硼酸法 0.15 mol.L-1 Tris-硼酸缓冲
液 (pH 7.5) 内含0.05 mol.L-1 EDTA-Na、0.5 mol.L-1
NaCl、4%SDS、2% b- 巯基乙醇，用硼酸调 pH
至 7.5。TSSE溶液含40 mmol.L-1 Tris-HCl (pH
7.5)、20 mmol.L-1 NaAc、5 mmol.L-1 EDTA、
1% SDS。其它试剂：5 mol.L-1 KAc (pH 6.5); 8
mol.L-1 LiCl；酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1；
80%乙醇 (pH 5.0); 3 mol.L-1 NaAc(pH 5.2)。
称取 1 g荔枝幼胚，加入0.2 mL b-巯基乙
醇，液氮中充分研磨成粉状，然后加入 10 mL 于
-20℃下预冷过的80%乙醇(pH 5.0)，继续研磨匀
浆，分装于6~7 只 1.5 mL 干净离心管中，于4℃
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下以12 000 × g 离心 10 min；上清液弃去，每
管分别加入1 mL 于 -20℃下预冷过的80% 乙醇，
悬浮，4℃下以12 000× g离心 10 min；上清液
弃去，每管分别加入0.6 mL Tris- 硼酸缓冲液，
悬浮沉淀，再加入1/4体积的无水乙醇和0.11倍
体积的 KAc(5 mol.L-1, pH 6.5)，混匀后，每管
再分别加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶
1)，冰上放置5 min，于4 ℃下以12 000× g离
心10 min;上清液转入1.5 mL Ependorf管中，加
入等体积酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，室
温下以 12 000 × g 离心 5 min；重复上述步骤，
直至无白色界面物质；取上清液，加入1/3体积的
8 mol.L-1 LiCl，置于 -20℃下过夜，次日于4℃下
以12 000× g离心 20 min；沉淀用100 mL TSSE
溶液溶解，室温下以12 000 × g离心 2 min；取
上清液，加入1/10 体积的NaAc (3 mol.L-1, pH 5.2)
和2倍体积的无水乙醇，-70℃下放置30 min，后
于 4℃下以12 000× g离心 20 min；沉淀分别用
70% 乙醇和无水乙醇1 mL 洗涤，凉干，用20~30
mL 无菌水溶解，样品贮藏于 - 7 0℃下备用。
3.2 试剂盒法 用上海博彩生物科技有限公司生产
的3S 柱式细胞及组织总 RNA 抽提试剂盒 V2.0 直
接提取荔枝幼胚中的总 RNA 也能获得比较满意的
效果。具体操作步骤和注意事项可参照说明书进
行。
4 RNA 含量、纯度和完整性检测
将上述两种方法提取的 3 个荔枝品种胚的
RNA 产品适当稀释后，用 Pharmacia 紫外分光光
度计检测，记录 A260/A280 比值，并按 Davey 等[7]
的方法对 RNA 进行甲醛变性胶电泳分析。
结果与讨论
从实验结果看，改良后的Tris-硼酸法和3S
柱式细胞及组织总 RNA 抽提试剂盒 V2.0 法均能
从黑叶、妃子笑、桂味等荔枝的胚中提取出高
质量的 RNA。所提 RNA 样品的 A260/A280 在 1.91~
2.02之间 (表1)，表明用这两种方法提取的样品可
成功地去除多酚类物质、多糖、蛋白质及 D N A
的污染。提取的总 RNA 以 1% 甲醛变性琼脂糖凝
胶进行电泳的结果显示，两种方法提取的总 RNA
完整性好，无降解 (图 1)。我们用这两种方法提
取的桂味和黑叶 RNA 进行抑制性消减杂交实验，
已成功克隆了S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因等几个
与荔枝胚败育相关基因的 cDNA 片段，并以其序
列设计3′及 5′引物，利用GeneRacerTM Kit 对两
种方法提取的桂味 RNA 进行反转录，又成功扩增
了该基因的全长cDNA 序列 (另文发表)。这说明
用这两种方法提取得到的荔枝胚 RNA 完全适用于
分子生物学研究。
表1 荔枝胚中提取的总RNA样品的A260/A280值
荔枝品种 3S Kit 改良的Tris-硼酸法
桂味 1.97 1.95
妃子笑 2.02 1.91
黑叶 19.8 1.93
图1 荔枝幼胚中提取的总RNA的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳
A: 用3S试剂盒法; B: 用改良的Tris-硼酸法。
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在荔枝胚RNA 提取过程中，多酚类物质不仅
易被氧化产生褐变，而且氧化后的酚类化合物会
与 R N A 不可逆结合，从而导致 R N A 活性丧失，
以及用苯酚、氯仿抽提时 RNA 的丢失[8]，或形成
不溶性复合物[9]。常规的去除多酚类物质的方法
是在提取 RNA 时加入一定量的 PVP，但 PV P 在
有效去除多酚类物质的同时，亦携带走大量的
RNA，以致 RNA 含量低于 LiCl 沉淀所必需的 RNA
浓度的下限，而不能沉淀出 RNA [10 ]。改良后的
Tris-硼酸法用80%的乙醇 (pH 5.0)对荔枝胚进行
预处理，可去除大部分多酚类物质; 基于硼酸可以
与酚类化合物依靠氢键形成复合物，从而抑制酚
类物质的氧化及其与 RNA 结合的特性，成功地排
除了荔枝胚RNA提取过程中多酚类物质的干扰; 再
通过 KAc 与无水乙醇的联用沉淀去多糖。这样，
在提取过程中不加PVP，即可取得很好的效果。用
3S柱式细胞及组织总RNA抽提试剂盒V2.0 法提取
荔枝胚的总RNA有几点值得注意：(1)荔枝幼胚的
质量不能超过150 mg。过量的材料将会破坏系统
的缓冲能力，无法获得高质量的 R N A ，甚至无
RNA。(2)将样品转移到无菌的Eppendorf 管中后，
要保证样品未融化。这主要是降低各种酶的活
性，防止多酚类物质被氧化及与 R N A 不可逆结
合。(3)加入 RLT 溶液到样品后，不能按说明书中
要求的在 56℃水浴中保温的程序去操作，放置在
室温下 3~5 min 即可。56℃水浴中保温可导致荔
枝胚中的淀粉糊化，离心时堵塞柱子。
参考文献
1 Chirgwin JM, Przybyla AE, Mac Donald RJ et al. Isolation of
biologically active ribonucleic acid from sources enriched in
ribonucleases. Biochem, 1979, 18:5294~5301
2 顾红雅, 瞿礼嘉, 明小天等. 植物基因与分子操作. 北京: 北京
大学出版社, 1995.77~78
3 Murray MG, Thompson WF. Rapid isolation of high molecular
weight plant DNA. Nucleic Acid Res, 1980, (8): 4321~4325
4 López-Gómez R, Gómez-Lim MA. A method for extracting
intact RNA from fruits rich in polysaccharides using mango
mesocarp. Hortic Sci, 1992,27(5):440~442
5 陈昆松, 徐昌杰, 张上隆等. 富含多糖猕猴桃果实组织中总
RNA提取方法的改进. 植物生理学通讯, 1998, 34(5):371~373
6 李宏, 王新力, 彭学贤等. 香蕉不同组织中总RNA的有效分离.
植物生理学通讯, 1999, 35(5): 384~388
7 Davey RB, Wallia KA, Boweing K. Adhesive contract madiaan
update on graft fixating and burn scar management. Burns, 1991,
17(4):313~315
8 Schneiderbauer A, Sandermann HJ, Ernst D. Isolation of func-
tional RNA from plant tissues rich in phenolic compounds. Anal
Biochem, 1991,197:91~95
9 Graham GC. A method for extraction of total RNA from Pinus
radiata and other conifers. Plant Mol Biol Rep, 1993,11:32~37
10 Manning K. Isolation of nucleic acids from plants by differen-
tial solvent precipitation. Anal Biochem, 1991,195:45~50