全 文 ：植物生理学通讯 第40卷第6期，2004年12月 721
一一———————————————————————————————————————————————————————————一
测定植物组织中NH4+浓度的荧光法
陆彬彬张吉张楚富+周卫
武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室，生命科学学院，武汉430072
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LUBin．Bin，ZHANGJi，ZHANGChu．Fu+，ZHOUWbi
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430072
提要NH。+与荧光试剂邻苯二醛(0PA)产生衍生作用后，用高效液相色谱仪(HPLc)作荧光定量分析，可以在数分钟内快
速而准确地检测到植物组织提取液以及介质中的NH。+含量。
关键词铵离子；测定；荧光分析；谷氨酰胺合成酶
NH4+是高等植物的一种重要的氮(N)素营养和
氮素代谢的产物。植物根吸收外源NH4+后在谷氨
酰胺合成酶(glutaIIlinesynthetase，GS)和谷氨酸合
酶(glutamatesynthase，GOGAT)构成的循环反应
中将其同化成谷氨酰胺和谷氨酸⋯。
通常认为，根吸收的外源NH。+大部分在根中
同化，只有少数转运到叶片中【2】。叶片生理代谢
活动中产生的NH。+也很快同化，不会在叶片组织
内积累。为了研究植物组织对NH。+的吸收及同化
和利用的效率，必须建立一种灵敏的方法，以便
能对组织抽提液和培养介质中的NH。+进行快速、
准确的测定。但是，通常采用的奈氏试剂法操作
繁琐、耗时，且易受到氨基酸、多胺类物质及
蛋白质的干扰而不准确，灵敏度和重复性也差。
邻苯二醛(OPA)可以同NH。+发生衍生作用
(derivatization)‘31。OPA是荧光试剂，将此反应与
HPLC相结合，可以检测NH。+。虽然此反应同样
也会受到某些因素的干扰，但是当pH值降至6．8
左右、并加入2一巯基乙醇作为还原剂时，对NH4+
的检出具有很强的专一性和极高的灵敏度【4】。本
文介绍了此法的原理、操作过程，并且以在不同
温度下生长的水稻幼苗为材料进行了实例分析。
材料与方法
于30℃人工气候箱中培养5d左右，进行如下处
理：一部分继续放在30℃下生长；另一部分转
至低温20℃中生长。湿度为60％～70％，光照
度为60mol·m～．s～，每天光照14h。定时对水
稻生长的营养液取样，测定NH。+浓度和pH值。
以上处理72h后，将水稻根洗净、吸干水
分、分装称重后置于低温冰箱中保存或立即用于
组织抽提。加入少许石英砂，按l：3的比例加
抽提液于研钵中进行匀浆(4℃)。抽提液成分为：
100mmol·L。1Tris—HCl(pH7．6)、1．Ommol·L‘1
EDTA、1．0mmol·L。1MgCl2·6H20、10mmol·L。1
2．巯基乙醇。于4℃下12000×．g离心30岫，收集
上清液，即为粗酶抽提液，’用于NH。+浓度和GS
酶活性的测定。
2测定
2．1仪器高效液相色谱仪(HPICA鲫ent1100s鲥es，
USA)。
2_2oPA试剂由磷酸盐缓冲液、oPA和巯基乙醇组
成，新鲜配制。各组分浓度如下：100mm01．LJ磷
酸盐缓冲液、3mm01．L。1OPA、10mm 1．L’12一巯
基乙醇。磷酸盐缓冲液由等摩尔Na：HPO。和
NaH2P04组成，溶液的pH值为6．8。配制好的OPA
试剂以O．2pm微孔滤膜过滤后备用。1实验材料——
。．水稻‘?删鼍s口rzⅧ)品种独优甜竺!gc·：妻掌芸嚣蓄芸嚣鬈学』笺。2君嚣毒!。28
消毒、浸种、催芽处理后移栽至会氮莹莠液口1中 、幸。灏赫蚤{1睡阳赫赫涵i。Z二僦位787867314)。
万方数据
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2．3操作流程参见文献3和4。OPA试剂流经唧C
泵，含NH。+样品由加样环注入。样品与OPA试
剂混合后，于63℃下发生衍生作用，产生荧光物
质，由HPLC的荧光监测器自动检测并记录峰
值。流速1mL．min一，每个样品的检出时间大约
在5min左右。上样量5“L。荧光检测的激发波
长和发射波长分别为410和470nm。以不同浓度
的NH。cl溶液作标准曲线。
2．4GS潘呦0定GS潘l生测定参照文献6进行。1个
GS活性单位定义为于37℃下每分钟催化产生
1¨molY_谷氨酰基异羟肟酸(Y．glutarnylhydmx锄ate)
所需要的酶量。
实验结果
l标准曲线的制作
如图1所示。在0~5mm01．L。1NHdCl范围内，
荧光值与NH。Cl浓度呈现非常好的线性正相关。
2不同温度下水稻幼苗营养液中NH4+和pH值的
变化
对水稻营养液中的NH4+和pH值进行了连续测
蓁
冬
O0．5 1．01．5 2．02．53．O3．5tO415&05．5
NH‘c1浓度／哪l·p
图1NH。+标准曲线
定，如图2所示。植物根组织吸收NH。+的同时
释放出H+，因而营养液中NH4+和pH显著下降。
20℃下两者下降的幅度大一些，显示在较低的温
度下，NH。+吸收多些。
3不同温度下水稻根组织中NH。+的积累
在水稻幼苗生长72h后，在20和30℃下，
根提取液中的NH。+浓度分别是0．38和0．35
I姗ol·L．1(图3)。20℃下生长的水稻根部NH。+浓度
增高7％。与此同时，20℃下营养液中残留的NH，
图2营养液中NH。+浓度(A)和pH值(B)变化曲线
30℃ 20℃
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图3低温处理下水稻根粗抽提液中N】‰+的积累 凰4低温处理下水獠根趣抽挺液中Gs的活性
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万方数据
植物生理学通讯 第40卷第6期，2004年12月 723
浓度比30℃下减少10％。营养液中NH。+的吸收与
根部NH。+的积累大体上是一致的。
4不同温度下水稻根组织中的GS活性
低温明显促进GS活性的增加(图4)。20℃下
GS活性比30℃下的提高50％左右，说明低温有
助于NH。+的同化。这可能有助于解释水稻根中
NH。+积累与营养液中NH。+的降低之所以不完全成
对应关系的原因。因为在低温下生长的水稻根的
GS活性明显高于30℃下的，而GS的高活性可以
加速NH。+的同化，从而导致根提取液中NH。+并
没有明显积累。这些结果表明较低的温度有助于
NH。+的吸收以及GS活性的增高，而增高的GS活
性又可以反过来促进NH。+的同化。
讨 论
本文的方法可以消除其它氮代谢物的干扰，且
重复性很好，灵敏度高。对于5和20uL的上样量
来说，其检测极限分别为1．0和O．25姗01．L_1【31。如
果把pH从6．8升高至11．0，用SO。2。作为还原剂的
话，检测极限甚至可以达到O．02um01．L～，这是常
规的化学检测法不能做到的【"。当然，这个检测极
限的增加是以NH。+选择性的降低为基础的，可能
会受到某些特殊的氨基酸如Glv、Ala、Gln的严
重干扰。
文中给出的OPA试剂配方适用于常规分析。
如果想得到更高的灵敏度，OPA的浓度可以增高
至10mmol·L～。如果需要更大的缓冲能力来维持
pH值的相对稳定(这与样品的pH有关)，可以将磷
酸盐缓冲液的浓度增至200mm01．L～。上样量主
要与灵敏度、线性范围以及样品的pH值有关，应
根据实际情况作具体调整。对于5“L乃至更小的
上样量来说，建议使用自动加样器，因为样品体
积的微小改变都可能导致荧光吸收值产生极大偏
差。另外一个值得注意的问题是保留时间。因为
无需过柱，OPA试剂与样品瞬间即可汇合，导致
保留时间太短，反应不充分。根据我们的经验，
对此可增加一段合适长度的塑料管，让缓冲液流
经该管再与样品反应以延长反应时间，同时对流
速加以控制。一般说来，保留时间应大于2min。
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