全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第5期，2005年10月 583
小麦高分子量麦谷蛋白亚基1Dx5启动子驱动外源基因的表达
姚琴 丛玲 罗立廷 李三和 何光源*
华中科技大学生命科学与技术学院，中英 HUST-RRes 基因工程与基因组学联合实验室，武汉 430074
提要 将小麦高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)基因的胚乳组织特异性表达启动子驱动的外源突变型 1Dx5 基因和 gus 基
因导入小麦中。 对其转基因植株连续3代的跟踪研究表明， 突变型1Dx5基因的重复序列导致其表达蛋白分子量增大，并
影响其它 1Bx17+1By18 亚基基因的表达。组织化学分析观察到gus 基因在1Dx5 基因启动子驱动下的表达表现出胚乳组织
特异性，在开花 2 周后开始表达，表达量呈持续上升，至腊熟期达到最高，其次为籽粒成熟期。
关键词 突变型；高分子量麦谷蛋白亚基；特异性表达
Expression of Foreign Genes in Wheat (Triticum aestivum L.) Drived by HMW-
GS 1Dx5 Promoter
YAO Qin, CONG Ling, LUO Li-Ting, LI San-He, HE Guang-Yuan*
China-UK HUST-RRes Genetic Engineering & Genomic Joint Laboratory, College of Life Science & Technology, Huazhong
University of Science & Technology, Wuhan 430074, China
Abstract The foreign genes including gus and 1Dx5 mutant engineered to possess more of the repetitive central
domain drived by HMW-GS (high molecular weight glutenin subunits) promoter were introduced into wheat,
which allows obtaining the stable expression transplant. The consecutive investigation in 3 progenies indicated
the repetitive sequence of 1Dx5 mutant improved its molecular weight and influenced expression of 1Bx17+1By18.
To test tissue specificity, the gus tests in seeds of transgenic plants exhibited positively, but negatively in leaves,
roots, anthers or pollens. Foreign gus gene began to express two weeks after flowering, and expression levels
kept increased trend to waxy ripening stage.
Key words mutant; high molecular weight glutenin subunits; specific expression
收稿 2004-12-15 修定 　 2005-07-11
资助　 国家高新技术项目“863”计划(2002 AA 224031)。
*通讯作者(E-mail: guang.he@bbsrc.ac.uk, Tel: 027-
87556214)。
小麦(Triticum aestivum L.)高分子量麦谷蛋白
亚基(high molecular weight glutenin subunits, HMW-
GS)是决定面筋弹性的主要因素，它是由小麦第
一染色体组(1A、1B、1D)长臂端的Glu-1 位点编
码的。每个位点有2个基因，分别编码1个 x-型
亚基和1个较低分子量的y-型亚基。其中，1Dx5
基因是位于1D长臂端的小麦高分子量蛋白5亚基
编码基因。从理论上讲，1Dx5 基因编码序列的
重复加长将导致其表达蛋白分子量增加。研究
1Dx5人工突变型基因表达调控，可为进一步了解
1Dx5 基因的表达调控机制奠定基础，另外，启
动子是外源基因在受体细胞中表达所必需的，它
决定了基因表达的时间、空间和强度等，是对生
物进行定向改造的限制因素之一。1Dx5基因在小
麦胚乳组织中表现出组织特异性[1]，利用其启动
子对下游基因的特异性表达调控，在小麦的品质
改良有一定意义[2,3]。本文以1Dx5基因的启动子，
分别与麦属作物基因人工突变型1Dx5-R853[4]以及
非麦属作物基因gus基因构建转基因表达载体，并
转入小麦得到了特异性表达的转基因植株，同
时，对1Dx5基因的启动子调控下的外源人工突变
1Dx5-R853 基因和 gus 基因作了探讨。
材料与方法
以小麦(Triticum aestivum L.) L88-31(仅有
1Bx17和 1By18亚基)为转基因受体材料，转基因
的表达载体为pLRPTDx5-R853， pLRPTDx5-R853
研究报告 Original Papers
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的启动子为1Dx5基因的启动子，目的基因是1Dx5
突变体(它是在野生型1Dx5的第2 088位核苷酸中
间插入一段1Dx5重复序列片段，长度为462 bp，
命名为 1Dx5-R853)，获得 2 株小麦转基因植株，
分别命名为 L9 和 L10。受体材料同上，表达载
体为pLRPTGUS[5]，启动子同上，目的基因为gus
基因，获得的转基因植株命名为 L11。
用L88-31近等位株系L88-6 (有1Ax1、1Bx17、
1By18、1Dx5 和 1Dy10亚基)为阳性对照[6]。L88-
31 和 L88-6 的内源 HMW-GS 均为野生型。
Taq酶购自 ABGene公司，其他试剂均为国产
分析纯。比较已经报道的 1Dx5 基因和 gus 基因，
根据保守区域，设计两对简并引物，即 1Dx5 的
上游引物为：5 GCCTAGCAACCTTCACAATC 3，
下游引物为：5 GAAACCTGCTGCGGACAAG 3；
gus 基因的上游引物为：5 AGTGTACGTATCAC-
CGTTTGTGTGAAC 3，下游引物为：5 ATCGC-
CGCTTTGGACATACCATCCGTA 3。
取 L9、L10 和 L11 的 T0、T1、T2 代种植于
人工气候室中，光暗周期16/8 h，光照度700 mmol·
m-2·s-1，温度 18/16℃。提取三叶期到五叶期间的
叶片基因组 DNA, 进行 PCR 验证。gus 的 PCR 反
应程序为94℃变性5 min，62℃退火30 s，72℃延
伸 2 min，1 个循环；94℃变性 5 min，62℃退
火30 s，72℃延伸2 min 3 s，30个循环；72℃延
伸 10 min，1 个循环。1Dx5-R853 的 PCR 扩增程
序中的延伸温度为 56℃。1% 琼脂糖凝胶电泳检
测扩增产物。
采用Shewry等[7]的方法提取L9、L10以及对
照L88-31和 L88-6系的子代胚乳总蛋白：小麦种
子磨成粉末状，加入25 mL·mg-1 蛋白提取缓冲液
[62.5 mmol·L-1 Tris-HCl、2% (V/V) SDS、1.5%
二硫苏糖醇、10% (V/V)甘油和 0.002% 溴酚蓝]。
10% SDS-PAGE 电泳分析小麦 HMW-GS 组分。
用GUS缓冲液浸润分析法[8]分析L11子代的各
种不同器官 gus 表达情况，GUS 显色反应底物为
X-Gluc(5-bromo-4-chloro-3-indolyl b-glucuronide)。
将植物的组织器官切成小块，浸泡在X-Gluc缓冲
液中，37℃中温育24 h。70%~100% 乙醇梯度脱
色。
图1 pLRPTGUS 转基因后代的 PCR 鉴定
Fig.1 PCR analysis of T1 progeny of line 1 for
the pLRPTGUS transgenes
　　M: 1 kb DNA梯度标记; 1: pLRPTGUS 质粒对照; 2: 空白对
照; 3~6: T1 代转基因材料。
图 2 pLRPTDx5-R853转基因后代的PCR鉴定
Fig.2 PCR analysis of T1 progeny of line 1 for
the pLRPTDx5-R863 transgenes
　　M: 1 kb DNA梯度标记; 1: pLRPTGUS 质粒对照; 2: 空白对
照; 3~6: T1 代转基因材料。
实验结果
1 转基因后代鉴定
以L9 和 L10 的 T1、T2、T3 的叶片基因组DNA
为模板，在 L9、L10 和 L11 的 T1、T2、T3 代中
分别检测到突变型1Dx5-R853基因和gus基因(图
1、2)。表明外源基因1Dx5-R853和 gus基因已经
整合入转基因受体材料后代基因组中。
2 突变型1Dx5-R853基因的表达
SDS-PAGE 结果表明转基因后代一般有 3 条
HMW-GS 条带，分别是 1Bx17、1By18 和 1Dx5-
R 8 5 3。其中，亚基分子量明显大于阳性对照系
L88-6 系野生型 1Dx5 亚基，甚至大于其 1Ax1 亚
基的分子量(图3)，这也说明了1Dx5-R853能够在
1Dx5 启动子的作用下于胚乳组织中表达。
通过Gel-Doc分析SDS-PAGE中蛋白质点密度
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图3 pLRPTDx5-R853转基因后代L9系的 SDS-PAGE分析
Fig.3 SDS-PAGE analysis of T1/T2/T3 progeny of
line 1 for the transplant lines L9
　　L88-31: 受体材料; L88-6: 阳性对照; T1: T1代; T2: T2代;
T3: T3 代。
表1 小麦转基因后代的SDS-PAGE点密度
Table 1 Densitometric analysis of SDS-PAGE of endosperm protein from transgenic wheat
编号 种子数目 HMW-GS / % 1Dx5-R853 / % 1Bx17+1By18 / %
L88-31 5 3.1±0.02 — 3.1±0.01
L88-6 5 9.2±0.02 1.7±0.01 3.0±0.01
L 9 5T 1 6.5±0.01 2.6±0.01 3.9±0.02
5T 2 6.3±0.04 2.3±0.10 4.0±0.02
10T3 6.2±0.05 2.2±0.03 3.8±0.03
L10 5T 1 5.9±0.20 2.2±0.02 3.6±0.03
5T 2 6.3±0.04 2.5±0.01 3.8±0.03
10T3 6.0±0.01 2.2±0.04 3.8±0.01
图4 转基因后代不同组织的GUS表达
Fig.4 GUS expression of different tissues
含量，统计结果(表 1)表明：受体材料L88-31 的
高分子量蛋白亚基在胚乳总蛋白的含量由3.1%最
高可达 6.2%，在转基因后代胚乳组织中 1Dx5-
R853 亚基占胚乳总蛋白最高可达 2.6%，相对于
阳性对照L88-6中高分子量蛋白1Dx5亚基1.7%的
平均含量，在数量上有一定的提高，说明 1Dx5
的启动子不仅可以启动1Dx5-R853 的表达，而且
在胚乳组织中也有较强的表达信号。
3 外源gus基因的特异性表达
分别取小麦植株分蘖期的根与幼叶、拔节期
的根与叶、抽穗期叶与幼穗，开花期花粉与花药
组织以及开花后 2 周的幼胚组织，组织化学检测
的结果表明，gus基因仅在小麦开花后2周的幼胚
组织中开始有表达，并在腊熟期 gus 表达活性达
到最高。gus 基因的表达仅限于 T1、T2 和 T3 代转
基因植物的胚乳中，在胚、糊粉层或其它器官
(叶、根、花粉和胚芽)中均不见表达(图 4)。
讨　　论
种子蛋白基因的特异性表达在水稻、番茄、
玉米等作物中都已有一定的研究，但在小麦中尚
少。为此，我们将 1Dx5 基因启动子驱动的麦属
突变基因(1Dx5-R853)和非麦属基因(gus)引入小麦
组织中，得到了稳定表达的转基因后代。本文结
果表明，转基因植株L10 种 1Dx5-R853 突变型转
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基因后代中 1Bx17+1By18 基因亚基含量最高达
3.8%，比受体材料L88-31的 3.1%含量高出0.7%。
说明在胚乳形成麦谷蛋白聚合体时，不仅表现出
加性效应，还存在互作效应[9]，本文结果支持这
一论点。
标记基因gus仅在胚乳组织中有较强的表达信
号，并且在小麦开花 2 周后开始表达，腊熟期表
达水平最高。在植物发育过程中，腊熟期是蛋白
质与淀粉累积的高峰期，是相关基因表达的高
峰。这与前人研究报道的1Dx5基因在小麦胚乳形
成期中表达水平曲线变化[10 ]一致。据此我们认
为，外源基因的胚乳组织特异性表达是由1Dx5启
动子调控的。
在1Dx5的启动子的作用下，两种基因不仅在
其 T0 中表达，而且在其 T1、T2 和 T3 中均能稳定
地表达，但在其子代中尚未观察到基因沉默的现
象。本文中1Dx5的启动子对两种基因有作用，它
不仅作用于麦属基因的表达，而且也作用于非麦
基因的表达，更为重要的是，该启动子能够特异
性调控外源基因仅在胚乳细胞中表达。因此，如
果想将麦属基因或非麦属基因仅在胚乳细胞中特异
性表达，则在寻找表达载体的启动子时，1Dx5的
启动子可作为备选启动子，让外源基因在特定时
期选定的部位中充分表达。
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