全 文 ：植物生理学通讯 第 41卷 第 1期，2005年 2月 23
除虫菊细胞的悬浮培养
李小六* 陈超 李艳梅 石洪凌 王红美
唐山师范学院生物科学技术系， 唐山 063000
提要 除虫菊悬浮细胞从培养后第 8 天开始迅速生长，14 d 达到最大生长量，其最适培养基为：MS+4 mg·L-1 2,4-D+0.1
mg·L-1 NAA+0.3 mg·L-1 6-BA+30 g·L-1 蔗糖，最适接种量为 15 g·L-1，摇瓶装液的体积分数为 40%，初始培养的最适 pH 值
为 5.8，收获时 pH 下降为 4.6±1，最适培养温度为 25℃。
关键词 除虫菊；细胞悬浮培养；生长条件
Cell Suspension Culture of Pyrethrum cinerariifolium
LI Xiao-Liu*, CHEN Chao, LI Yan-Mei, SHI Hong-Ling, WANG Hong-Mei
Department of Biological Science and Technology, Tangshan Teachers College, Tangshan 063000
Abstract The rapid growth of Pyrethrum cinerariifolium suspension culture cell was on the 8th day and the
maximum growth amount was obtained on the 14th day. The optimum medium was MS added 2,4-D 4 mg·L-1
and NAA 0.1 mg·L-1, 6-BA 0.3 mg·L-1 and sucrose 30 g·L-1. The optimum culture situations were obtained as
follows: seed volume was 15 g·L-1, the liquid medium volume per flask was 40%, the initial pH was 5.8, the last
pH was 4.6±1, the optimum temperature was 25℃.
Key words Pyrethrum cinerariifolium; cell suspension culture; growth condition
从除虫菊经提取和加工后获得的除虫菊酯生
物农药，具有快速、高效、安全的优点。目前，
除虫菊酯主要从除虫菊干花中提取，其环节多，
耗时费力，且产量受环境和季节限制, 以致除虫菊
酯的生产成本高，产量低，难以满足市场需求。
本文以除虫菊花蕾为材料，诱导愈伤组织，进行
细胞的悬浮培养，获得了较为稳定的细胞悬浮
系，并对悬浮细胞生长的优化条件作了探讨，目
的是用植物生物反应器建立大规模除虫菊细胞培养
体系，大量生产除虫菊酯等杀虫成分，进而工厂
化生产天然除虫菊酯杀虫剂。植物反应器生产除
虫菊酯可节约土地，投资小，产出高，有一定
的开发前景。国内有关除虫菊组织培养的研究多
集中在愈伤组织的诱导和植株再生[1]，关于细胞
悬浮培养尚未见报道。
材料与方法
取除虫菊(Pyrethrum cinerariifolium)未成熟花
蕾，于4℃下处理24 h，70% 乙醇消毒30 s，再
转入0.1% HgCl2 溶液中消毒5 min，无菌水冲洗
3~4 次，剥去花萼后接种。初始诱导及继代培养
基为：MS+2 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1 NAA+0.1
收稿 2004-03-18 修定 　 2004-08-25
资助　 唐山市科技局硕博基金(02813031A-4-1)、河北省教
育厅自然科学研究计划项目(Z2002202)。
* E-mail：lixiaoliu666@163.com, Tel:0315-3885207
mg·L-1 6-BA+20 g·L-1 蔗糖，琼脂5 g·L-1，pH 5.8；
初始液体培养基同上，不加琼脂。取 1.5 g 继代
培养20 d 的愈伤组织，接入装有 30 mL 液体培
养基的100 mL三角瓶中进行细胞悬浮培养，摇床
转速为80 r·min-1, 12 d继代一次，筛选建立稳定
的细胞悬浮培养系，并进行细胞学观察[2]。
细胞生长量测定采用细胞干重法，将愈伤组
织细胞或细胞悬浮培养液过滤得到的细胞培养物，
在烘箱( 6 0 ℃) 中烘干至恒重，称重即得干重
( D W )。每个处理重复 3 次。
测定细胞生长曲线时，于无菌环境下称取
1.5 g湿重除虫菊愈伤组织，接入装有100 mL液
体培养基的250 mL三角瓶中，放在摇床上进行悬
浮细胞培养，摇床转速80 r·min-1，温度为25℃。
每 2 d 取 3 瓶，测定细胞生长量，并测定相应的
过滤液的 pH 值[3~6]。
在我们以往工作的基础上，对2,4-D、NAA、
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6-BA、蔗糖4个因素3个水平进行正交试验[7]，共
9种培养基(各 6 瓶)，正交实验的因素水平表见
表 1 。
结果与讨论
1 优化培养基的选择
采用L9(34)表头设计进行正交试验，测定各
组合不同培养基成分影响悬浮细胞生长量(干重)，
并进行方差分析。结果表明(表2)， D因素(蔗糖)
的 R值为 0.0540，大于 B因素(NAA)、C 因素(6-
BA)和 A 因素(2,4-D)的 R 值。极差愈大，反映此
种因素水平变动时，指标的变化愈大，即该因素
对指标的影响愈大。由此，判断各因素对指标影
响的主次顺序为：蔗糖>NAA>6-BA>2,4-D，即
蔗糖对细胞生长的影响最大。根据正交实验，最
表2 正交试验L9(34)
Table 2 Orthogonal trial L9(34)
编号 A B C D 细胞增加量/g(DW)·L-1
1 1 1 1 1 0.2060
2 1 2 2 2 0.2232
3 1 3 3 3 0.1856
4 2 2 3 1 0.1684
5 2 3 1 2 0.2016
6 2 1 2 3 0.1892
7 3 3 2 1 0.1356
8 3 1 3 2 0.2468
9 3 2 1 3 0.2280
K 1 0.6148 0.6420 0.6356 0.5100
K 2 0.5592 0.6196 0.5480 0.6716
K 3 0.6104 0.5228 0.6008 0.6028
k1 0.2048 0.2140 0.2120 0.1700
k2 0.1864 0.2064 0.1868 0.2240
k3 0.2036 0.1744 0.2004 0.2008
R 0.0184 0.0396 0.0252 0.0540
　　主→次：D > B > C > A 。
表1 正交实验因素水平
Table 1 Factor level of orthogonal trial

水平
因素
A B C D
(2,4-D/mg·L-1) (NAA/mg·L-1) (6-BA/mg·L-1) (蔗糖/g·L-1)
1 2　 0.1 0.1 20.000
2 3 0.3 0.2 30.000
3 4 0.6 0.3 40.000
终确定8号培养基(MS+4 mg·L-1 2,4-D+0.1 mg·L-1
NAA+0.3 mg·L-1 6-BA+30 g·L-1 蔗糖)为除虫菊细胞
的最适培养基。
2 除虫菊花蕾愈伤组织的诱导、细胞悬浮培养系
的获得和细胞形态学观察
花蕾接入后，15 d后开始出现愈伤组织，初
期生长缓慢，转入继代培养基后，愈伤组织生长
加快，1 个月后可以增重数倍，出现了多种类型
的愈伤组织(图1-a)，黄色或淡黄色愈伤组织的细
胞大多为圆形，细胞之间联系紧密，多个细胞成
为细胞团(图 1-b)。每隔 20 d 继代一次。
图1-a所示的黄色或淡黄色愈伤组织转到液体
培养基上进行悬浮培养(图1-c)，初期的细胞不规
则，细胞质稀薄，有许多长形的细胞出现。每
隔 12 d 继代一次。随着继代次数的增加，不规
则的细胞减少，圆形或椭圆形的细胞增多(图1-d)。
3 除虫菊细胞的生长和生长进程
从图 2~7 可见：
(1)除虫菊悬浮细胞生长量随着时间的变化约
呈“S”形(图2)。接种后1~4 d内细胞生长缓慢；
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4~8 d后，生长加快；8~14 d内细胞迅速增殖，呈
直线上升趋势；在14 d时生长量达到最大，以后
细胞增殖减慢，直到衰老。在悬浮培养的前4 d，
pH值急剧下降，之后变化不大(图3)。
(2)随着接种量的增加，细胞增加量也随之增
大，接种量为 15 g·L-1，细胞的增加量最大，之
后细胞增加量随着接种量的增加而减小。这说明
悬浮细胞在其它条件相同的情况下，细胞生长有
一个最低接种密度，低于此密度时，细胞生长速
率就降低或根本不生长，而细胞干重一般是随着
接种量增加而增加的，接种量过大，营养物大量
消耗，而导致悬浮细胞生长缓慢。因此，接种
图1 除虫菊细胞悬浮培养
Fig.1 Cell suspension culture of Pyrethrum cinerariifolium
a.除虫菊花蕾诱导的愈伤组织; b.除虫菊愈伤组织的小细胞团(600×); c.除虫菊细胞悬浮培养物; d.除虫菊细胞悬浮培养的细胞(600×)。
图2 细胞生长曲线
Fig.2 The curve of cell growth
图3 悬浮细胞生长中pH值的变化
Fig.3 Change in pH in suspension cell growth
量选择15 g·L-1 为最好(图4)。
(3)随着装液量的增加，除虫菊细胞增加量增
图 4 接种量对细胞生长的影响
Fig.4 Effect of seed volume on cell growth
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大，100 mL时最大；大于100 mL时，细胞的增加
量而减小(图5)。这可能是装液量不同的培养基中
溶氧量高低不同造成的。
(4)除虫菊悬浮细胞培养至14 d时，进入对数
生长后期。此时取样分析的结果(图 6)显示：pH
值为5.8时，细胞生长量最大；pH值小于5.8时，
细胞生长量则随着 pH 值的降低而降低；pH 值大
于5.8时，细胞生长量随着pH值的增大而降低。说
明培养的最佳pH值为5.8。
(5)温度相对低的条件下，细胞增长缓慢，随
着温度的增加，细胞增加量也增大，25℃为最适
温度；温度继续升高时，细胞可能过早衰老以致
细胞增加量迅速下降(图 7)。
参考文献
1 陈宗莲, 侯岁稳, 俞宏渊. 除虫菊的组织培养. 云南
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2 孙敬三, 桂耀林. 植物细胞工程实验技术. 北京: 科学出版社,
1995. 36～38　　
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体的筛选. 核农学报, 1994, 8(1): 7~13
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生的研究. 生物工程学报, 1994, 15(2): 207~210
6 涂艺声, 江洪如, 王碧琴. 草珊瑚细胞悬浮培养之研究. 江西
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7 李春喜, 王志和, 王文林. 生物统计学. 第2版. 北京: 科学出
版社, 2000. 149~155
图5 装液量对细胞生长的影响
Fig.5 Effect of the liquid medium volume
per flask on cell growth
图6 pH值对细胞生长的影响
Fig.6 Effect of pH on cell growth
图7 温度对细胞生长的影响
Fig.7 Effect of temperature on cell growth