全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 6期，2008年 12月 1177
蝴蝶兰原生质体提取方法的优化
乔永旭 *, 张永平, 王桂兰, 陈超, 王燕
唐山师范学院生命科学系, 河北唐山 063000
Optimization of the Method for Isolating Protoplast of Phalaenopsis amabilis Bl.
QIAO Yong-Xu*, ZHANG Yong-Ping, WANG Gui-Lan, CHEN Chao, WANG Yan
Department of Life Sciences, Tangshan Teacher’s College, Tangshan, Heibei 063000, China
提要: 以蝴蝶兰自交品种 NOⅡ的无菌苗叶片为试材, 采用单因素试验和正交试验, 比较不同酶的种类、酶液浓度、材料
和酶液的比例、渗透压、酶解时间及纯化条件对原生质体产量和活性的影响, 并用荧光显微镜观察去壁情况。结果表明:
在同一种条件下1 g蝴蝶兰叶片加入10 mL酶解液中, 酶解液含1.0%纤维素酶R-10, 1.0%果胶酶, 0.5 mol·L-1甘露醇, 酶解3 h,
有活力的原生质体产量最高, 其产量为1.3×105个 ·g-1, 活性达81.90%。
关键词: 蝴蝶兰; 原生质体; 分离; 提取
收稿 2008-07-23 修定 2008-09-18
资助 河北省科技厅生物工程项目(04 5470 08D-2)。
﹡ E-mail: qiaoyx123@163.com; Tel: 0315-3306246
蝴蝶兰为兰科蝴蝶兰属植物, 是兰科植物中栽
培最广泛, 最受欢迎的种类之一(秦凡和周吉源
2003)。因其花姿高雅, 花色美丽, 花期较长, 在众
多的热带兰中有 “洋兰皇后 ”的美称。目前关于蝴
蝶兰组织培养的研究较多, 多采用组织培养来繁殖
种苗, 进行工厂化生产(魏琪等 2006), 而关于原生
质体的分离、纯化及培养的报道尚少( C hen 等
1991; Shrestha等 2007)。目前蝴蝶兰存在种性退
化等问题, 分离纯化蝴蝶兰原生质体可以在此基础
上进行原生质体培养, 对蝴蝶兰品种改良和培育新
品种有一定的意义(Shrestha等 2007)。本文以蝴
蝶兰自交品种‘NOII’无菌苗叶片为材料, 探索原生
质体提取的最适宜条件, 以期获得高产量和高活力
的原生质体, 为蝴蝶兰原生质体再生体系的建立作
参考。
材料与方法
2006年10月在我院生命科学系组培室内取试
管苗蝴蝶兰(Phalaenopsis amabilis Bl.)自交品种
‘NOII’ (我院自育粉红色品种)幼嫩叶片 0.5~2 g, 切成
2 mm×1 mm的块状, 然后放入 10 mL纤维素酶解
液中, 置于 25℃恒温摇床上以 20 r·min-1振荡酶解,
提取原生质体。酶解液成分为: 一定含量的纤维素
酶(cellulase Onzuka R-10)和果胶酶(pectinase T2445),
7 mmol·L-1 CaCl2·2H2O, 0.7 mmol·L-1 NaH2PO4·2H2O,
3 mmol·L-1 MES (C6H13NO4S), 0.3~0.5 mol·L-1甘露醇,
pH 5.8。酶液经 0.22 µm混合纤维素微孔滤膜过
滤除菌及杂质。
原生质体纯化采用过滤 -离心 -漂浮法进行纯
化(范春丽等 2005)。酶解结束后, 将原生质体连同
酶液用 300目的细胞筛网过滤离心, 以 500×g离心
3 min, 以沉淀原生质体, 去掉上清液, 缓慢加入 0.5
mL的细胞悬浮液(其组成为: CaCl2·2H2O 0.16 mol·L-1、
0.1%MES、甘露醇 0.5 mol·L-1, pH 5.8), 悬浮沉淀,
轻轻混匀后分装入离心管中。向离心管底部缓慢
注入 2 mL 15%~25%的蔗糖溶液, 以 500×g离心 5
min。用移液枪将漂浮于溶液界面间的原生质体带
轻轻吸出。原生质密度的测定采用血球计数板上
计数法测定。
试验采用0.1%的中性红染料对原生质体染色
检测其活性。细胞液泡被染成红色的是有活性的
原生质体 [原生质体活性=(液泡被染成红色的原生
质体数 /观察的原生质体总数)×100%]。具体方法:
以 1:1的比例向细胞悬浮液中加入中性红, 摇匀后
底部的沉淀漂浮, 然后向离心管底部缓慢注入2 mL
21%蔗糖, 离心纯化。用移液枪小心地吸出漂浮
于溶液界面间的原生质体, 置于血球计数板上计数,
镜检。每个处理计数时随机检查 20个视野, 统计
细胞不少于 100个, 每个处理重复 3次。
技术与方法 Techniques and Methods
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原生质体去壁后观察: 吸取原生质体悬浮液
0.1~0.2 mL加等体积的0.1%荧光增白剂(VBL型荧
光增白剂)混匀, 10 min后以手摇离心机离心, 吸去
上清液, 用细胞悬浮液洗涤3~4次, 重新悬浮后, 吸
一滴悬浮液置于载玻片上, 加盖玻片, 荧光显微镜
(BV激发)观察。
实验结果
1 原生质体提取方法的优化正交试验
选用 L9 (34)正交设计实验(表 1、2), 研究纤维
素酶 R-10浓度、果胶酶浓度、甘露醇浓度和酶
解时间的四因素对蝴蝶兰原生质体提取效果的影
响。
由表 2可以看出, RC>RB>RA>RD, 即在试验中
C因素(甘露醇浓度)对蝴蝶兰叶片原生质体产量和
活力的影响最大, B因素(果胶酶浓度)次之, A因素
(纤维素酶R-10浓度)的影响小于B因素, D因素(酶
解时间)的影响最小。比较各试验因子的总和或平
均数可知, A取A2、B取B3、C取 C2和D取D2为
好。所以蝴蝶兰叶片原生质体提取的优化组合为
A2B3C2D2, 即纤维素酶R-10浓度为1.0%, 果胶酶浓
度为 1.0%, 甘露醇浓度为 0.5 mol·L-1, 酶解时间为
3 h时(图 1-a), 获得有活力原生质体的产量最高。
由于选出的处理组合不在正交试验中, 还需再进行
一次试验, 以确定选出的处理组合是否最优。经试
验证明, 该处理组合原生质体的产量为1.3×105个·g-1,
原生质体的活力为81.9%, 有活力的原生质体(图1-
b)产量为 1.06×105个 ·g-1。所以该处理组合为提取
蝴蝶兰原生质体的优化组合。
2 纯化条件对原生质体提取的影响
通过比较浓度范围由15%~24%的4种不同浓
度的蔗糖悬浮对原生质体提取效果的影响(表3), 可
表 1 正交因素水平表

水平
因素
A (纤维素酶 R-10浓度)/% B (果胶酶浓度)/% C (甘露醇浓度)/% D (酶解时间)/h
1 0.8 0.6 0.3 2
2 1.0 0.8 0.5 3
3 1.2 1.0 0.7 4
表 2 蝴蝶兰原生质体提取正交试验结果的直观分析

处理
因素
原生质体产量 / 原生质体活力 /%
具活力原生质体产量 /

105个 ·g-1 (FW) 105个 ·g-1 (FW)
A B C D
1 1 (0.8) 1 (0.6) 1 (0.3) 1 (2) 0.6 66.59 0.40
2 1 (0.8) 2 (0.8) 2 (0.5) 2 (3) 1.1 79.88 0.88
3 1 (0.8) 3 (1.0) 3 (0.7) 3 (4) 0.3 60.43 0.18
4 2 (1.0) 1 (0.6) 2 (0.5) 3 (4) 1.2 74.68 0.90
5 2 (1.0) 2 (0.8) 3 (0.7) 1 (2) 0.1 70.74 0.07
6 2 (1.0) 3 (1.0) 1 (0.3) 2 (3) 1.6 41.11 0.66
7 3 (1.2) 1 (0.6) 3 (0.7) 2 (3) 0.1 52.63 0.05
8 3 (1.2) 2 (0.8) 1 (0.3) 3 (4) 0.5 85.21 0.43
9 3 (1.2) 3 (1.0) 2 (0.5) 1 (2) 1.3 75.96 0.99
T1 1.46 1.35 1.49 1.46
T2 1.63 1.38 2.77 1.59
T3 1.47 1.83 0.30 1.51
X1 0.49 0.45 0.50 0.49
X2 0.54 0.46 0.92 0.53
X3 0.49 0.61 0.10 0.50
R 0.05 0.16 0.82 0.04
　　T表示每个因素各水平之和; X表示每个因素各水平的平均数; R表示每个因素各水平平均数的极差。
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知用21%的蔗糖悬浮效果最好, 离心后得到的原生
质体条带清晰, 颜色深(图1-d ③), 原生质体产量最
高; 15%的蔗糖悬浮效果次之, 离心后在溶液界面
处形成一条颜色稍浅的绿色条带, 条带呈絮状, 下
面沉淀杂质多(图 1-d①), 原生质体产量较多; 18%
的蔗糖悬浮, 离心后得到的条带不明显, 颜色浅, 下
部杂质沉淀最少(图 1-d②); 24%的蔗糖悬浮得到
的原生质体条带颜色很浅, 在整个上层的细胞悬浮
液中都分布有原生质体(图 1-d④)。所以用漂浮法
对蝴蝶兰原生质体进行纯化时, 21%的蔗糖悬浮效
果最好。
质体产量为 1×105个 ·g-1, 材料增加 0.5 g, 原生质体
的产量增加到 1.6×105个 ·g-1, 再增加 0.5 g材料, 原
生质体的产量不变, 材料增加到 2 g时, 原生质体
的产量反而降低了。因此, 提取蝴蝶兰叶片原生质
体时, 材料和酶液的比例为1:10时, 提取效果最佳。
离心后得到的原生质体条带的情况如图1-e所
示, 加 0.5 g材料的条带很细, 颜色浅绿色(图 1-e
①); 加 1 g材料的条带均匀(图 1-e②), 比 0.5 g的
明显且颜色深; 加1.5 g材料的条带絮状, 部分聚集
成团块, 含原生质体较多, 颜色深(图 1-e③); 加 2 g
材料的条带絮状, 下部有很多的细胞壁残渣和没有
酶解完全的叶片组织(图 1-e④)。
图 1 蝴蝶兰原生质体的提取和活性
a: 酶解 3 h所提取的原生质体(×40); b: 中性红染色的原生质体(×40); c: 原生质体去壁情况(×20); d: 不同浓度蔗糖悬浮得到的原
生质体带(蔗糖浓度为① 15%, ② 18%, ③ 21%, ④ 24%); e: 不同材料和酶液比例所得原生质体带(叶片克数为① 0.5 g, ② 1.0 g, ③ 1.5 g,
④ 2 .0 g)。
3 材料和纤维素酶液的比例对原生质体提取的影
响
比较不同材料和酶液比例对原生质体提取的
影响(表4), 可知不同比例所得原生质体的产量明显
不同。当 10 mL酶解液中加入 0.5 g叶片时原生
表 3 不同蔗糖浓度对原生质体提取的影响
蔗糖浓度 /% 原生质体产量 /105个 ·g-1 (FW)
1 5 1.4
1 8 1.4
2 1 1.6
2 4 0.8
　　酶解液含 1%纤维素酶 R-10 和 1% 果胶酶, 甘露醇浓度为
0.3 mol·L-1, 酶解时间为 3 h。
表 4 不同材料和酶液比例对原生质体提取的影响
材料重量 /g 材料:酶液 /g:mL 原生质体产量 /105个 ·g-1 (FW)
0.5 1:20 1.0
1.0 2:20 1.6
1.5 3:20 1.6
2.0 4:20 0.75
　　酶解液含 1%纤维素酶 R-10 和 1%果胶酶, 甘露醇浓度为
0.3 mol·L-1, 酶解时间为 3 h, 以 21%的蔗糖悬浮。
4 原生质体去壁观察
在荧光显微镜下(BV激发), 可以观察到原生质
体质膜周缘没有蓝绿色荧光, 质膜内的叶绿体发红
色荧光, 而具有细胞壁的细胞则有明显的蓝绿色荧
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光(图 1-c)。说明所提取蝴蝶兰原生质体去壁率较
高, 去壁较彻底; 也证明了所选取酶的浓度, 甘露醇
浓度, 酶解时间较合理。
讨　　论
材料苗龄和叶龄对原生质体的产量有很大影
响(周蓉和陈小娟 1999)。分离原生质体, 一般选取
细胞分裂旺盛的幼嫩组织作材料。同时酶浓度和
酶解时间对原生质体的产量和活性也有较大影响,
尽可能应用低的酶浓度和尽可能短的酶解时间, 以
获取大量有活性的原生质体。如果酶解时间长则
导致较早游离出来的原生质体破裂。
据报道, 渗透压稳定剂一般是甘露醇、山梨
醇、蔗糖、葡萄糖等(陈名红等 2005)。在降解
细胞壁时, 渗透压稳定剂常和酶混合使用。本文中
以甘露醇作为渗透压稳定剂后, 结果证明, 当甘露
醇浓度在 0.3~0.7 mol·L-1范围内的 0.5 mol·L-1时,
原生质体的产量最高; 0.3 mol·L-1时原生质体的产
量降低; 0.7 mol·L-1时原生质体的产量最低。而周
春江等(2003)认为甘露醇浓度高于0.7 mol·L-1时, 原
生质体产量和活性反而下降。这可能是由于材料
不同或蝴蝶兰叶片原生质体提取过程中其他未知因
素的影响导致, 具体原因还待进一步探索。另外,
提取植物原生质体时, 纤维素酶和果胶酶的种类和
浓度对原生质体的产量也有很大影响(Durieu和
Ochatt 2000)。降解高等植物细胞壁一般由纤维素
酶、果胶酶及半纤维素酶中的一种或者多种配合
使用(严寒和田志宏 2005)。本文则采用纤维素酶
和果胶酶配合使用提取原生质体, 取得了较高的原
生质体产率。目前一般蝴蝶兰的繁殖以花梗芽的
组织培养为主, 这种方法繁殖系数低, 速度慢, 限制
了蝴蝶兰规模化生产的进度。而本文探索出的蝴
蝶兰原生质体可以大量提取的方法, 为今后蝴蝶兰
的大量生产建立了基础。
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