全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 6期，2008年 12月 1181
疣粒野生稻胚性悬浮细胞系的建立及其原生质体的培养和植株再生
蔺忠龙 1,2, 白现广 1,2, 吕广磊 2,3, 李维薇 1, 殷富有 2, 黄兴奇 2, 程在全 2,*
1云南大学生命科学学院, 昆明 650091; 2云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所, 昆明 650223; 3云南农业大学农业
与生物技术学院, 昆明 650201
Establishment of Embryogenic Cell Suspension Cultures and Plants Regenera-
tion from Protoplast Culture of Wild Rice Oryza meyeriana
LIN Zhong-Long1,2, BAI Xian-Guang1,2, LÜ Guang-Lei2,3, LI Wei-Wei1, YIN Fu-You2, HUANG Xing-Qi2, CHENG Zai-Quan2,*
1College of Life Sciences, Yunnan University, Kunming 650091, China; 2Biotechnology and Genetic Resources Institute, Yunnan
Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650223, China; 3Academy of Agricultural and Biotechnology, Yunnan Agricultural
University, Kunming 650201, China
提要: 云南疣粒野生稻的成熟种子经55 ℃温度处理3 d打破休眠后, 在诱导培养基上诱导出愈伤组织。挑选胚性愈伤组织
置于液体培养基中振荡培养, 经3个月的继代培养, 建立胚性细胞悬浮系。悬浮细胞经酶解、去壁后获得大量原生质体, 固
体包埋后添加液体培养基进行原生质体培养。在培养过程中调节培养体系的渗透压, 获得小愈伤组织; 经增殖后在分化培
养基上诱导产生胚状体, 成功得到疣粒野生稻的原生质体再生植株。
关键词: 疣粒野生稻; 悬浮培养; 原生质体; 植株再生
收稿 2008-09-22 修定 2008-10-23
资助 国家自然科学基金(30 4 60 0 1 9)、云南省科技攻关项目
(2006NG34)和云南省自然科学基金(2006C00007Q)。
* 通讯作者(E-ma il: czqua n-99@163.com; Tel: 0871-
5 1 1 1 8 6 3 )。
野生稻是栽培稻遗传改良的天然基因库, 其中
一些类型具有抗病、抗虫、耐寒、耐旱以及高
蛋白质含量等优良性状, 应用植物遗传操作技术将
野生稻的优良特性引入栽培稻, 对于栽培稻的品种
改良具有重要意义(应存山 1993)。疣粒野生稻是
我国现存的3种野生稻之一, 经鉴定对水稻白叶枯
病表现高抗或接近免疫, 高抗细菌性条斑病和稻飞
虱, 同时抗稻瘟病、螟虫, 是一种优良的种质资源
(朱永生等 2004)。然而, 疣粒野生稻属GG染色体
组, 与染色体组为AA的栽培稻属不同的种, 两者
存在生殖隔离 , 有性杂交很难成功(李良材等
1988)。采用体细胞融合技术可以解决此困难。开
展体细胞融合研究的基础是胚性悬浮细胞系的建立
及原生质体再生植株, 栽培稻原生质体再生植株在
近年已有重大突破和发展, 但疣粒野生稻的报道很
少。随着水稻原生质体培养技术体系的建立, 琼脂
糖包埋、热激冷处理、看护培养等方法的应用,
水稻原生质体培养的基因型范围不断扩大(颜秋生
等1995)。本文建立了良好的疣粒野生稻胚性细胞
悬浮系, 并在此基础上进行原生质体的游离培养, 得
到了再生植株。
材料与方法
1 试验材料
疣粒野生稻[Oryza meyeriana (Zoll. et Mor. ex
Steud.) Baill.], 采自云南省景洪县境内, 移栽到昆明
温室后供试验用。
2 试验方法
2.1 愈伤组织的诱导 外植体选用成熟种胚, 一部分
用 0.1%HgC12消毒 10 min后部分直接接种于含
3.0 mg·L-1 2,4-D的MS诱导培养基上暗培养; 另一
部分在55 ℃下处理3 d后, 再接种于相同的培养基
上。诱发愈伤组织后, 每隔 2 周用继代培养基
(MS+2 mg·L-1 2,4-D+500 mg·L-1脯氨酸 +500 mg·L-1
谷胺酰氨+300 mg·L-1水解酪蛋白+3%蔗糖, pH 5.8)
继代培养 1 次。
2.2 胚性悬浮系的建立 在继代 2~3次的胚性愈伤
组织中, 选择生长迅速、颜色淡黄、结构致密、
结合松散的小颗粒状愈伤组织, 接种于改良的液体
AA培养基中(秦发兰等 2001) (AA大量元素, 其中
微量元素及有机成分与B5培养基相同, 300 mg·L-1
水解酪蛋白, 500 mg·L-1脯氨酸, 500 mg·L-1谷氨酰
胺, 2 mg·L-1 2,4-D, 蔗糖 3.0%, pH 5.8), 黑暗条件振
荡培养, 温度为 27.5 ℃, 转速为 110 r·min-1, 每隔
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5~7 d 继代 1次。悬浮培养 3~4个月后, 建成良好
的胚性细胞悬浮系。
2.3 原生质体的游离培养 选取继代 3 d的悬浮细
胞, 置于混合酶液中游离原生质体, 每克悬浮细胞
加入 10 mL酶液。酶液组成为: 1.0%、1.5%和
2.0%的纤维素酶(Cellulase Onozuka RS), 0.1%和
0.2%果胶酶(Pectolyase Y-23), 5 mmol·L-1 MES,
CPW13 (27.2 mg·L-1 KH2PO4, 101 mg·L-1 KNO3, 1 480
mg·L-1 CaC12·2H2O, 246 mg·L-1 MgSO4·7H2O, 13%
甘露醇, pH 5.6)。游离原生质体时先在 50 r·min-1
摇床上黑暗酶解 3 h, 然后静置 1 h; 将混合液顺序
用孔径为 85 µm和 35 µm的尼龙网过滤, 收集滤
液, 500 r·min-1低速离心 5 min收集原生质体。离
心沉淀物用 CPW13 (CPW盐 +13%甘露醇)清洗 3
次, 最后用KM8p培养基(KM8p+2 mg·L-1 2,4-D+
0.2 mg·L-1 6-BA+500 mg·L-1水解酪蛋白+100 mg·L-1
脯氨酸 +10%葡萄糖浓度, pH 5.8)清洗 3次。纯
化后的原生质体在 45 ℃的水浴中热激 5 min后迅
速放进 0 ℃的冰水冷却 15 s, 然后用含 1.2%低熔
点琼脂糖的KM8p培养基包埋, 原生质体的最终植
板密度为 0.5×105~1×105个 ·mL-1, 进行暗培养。培
养 7~10 d时, 细胞进入第一次分裂高峰后, 加入适
量的KM8p降压培养基(基本成分与KM8p相同, 但
葡萄糖浓度均为1%, 蔗糖浓度为2%), 促进培养细
胞分裂, 10 d后统计再生细胞分裂频率。当出现
4~5次分裂的小细胞团时, 加入少量AA培养基(含
2 mg·L-1 2,4-D), 第 3周时统计植板率。长至肉眼
可见的愈伤组织时, 将愈伤组织转入预分化培养基
(N6+2.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1 NAA+1.5 mg·L-1 KT+60
g·L-1蔗糖 +1.0%琼脂)进行预分化。
2.4 植株再生 将直径 5 mm左右的愈伤组织块转
入分化培养基(N6+1.0 mg·L-1 6-BA+0.5 mg·L-1
NAA+1.5 mg·L-1 KT+30 g·L-1蔗糖 +0.8%琼脂)分
化, 光照时间14 h·d-1, 光照强度为36~40 µmol·m-2·s-1, 温
度为 27 ℃。待分化出小植株后计算再生愈伤组织
的分化频率(分化频率=出苗愈伤数 /分化愈伤数×
100%); 将再生植株转入生根培养基(1/2MS+0.5
mg·L-1 NAA)促进根和幼苗的生长, 苗长 4~5 cm时,
置于室温下炼苗 2~3 d后移栽。对照在再生细胞
分裂后不进行渗透压的调节, 再生的愈伤组织直接
进行分化。
结果与讨论
1 愈伤组织的诱导
从表 1可知, 成熟种子作外植体, 高温处理与
未处理相比, 出现愈伤组织时间提前, 愈伤组织出
现率提高, 这可能与野生稻的休眠期较长有关, 说
明适当的高温有利于打破休眠促进胚的萌动。这与
张伟和简玉瑜(1991)报道的高温处理普通野生稻
(O. rufipogon)可以提高成熟种子出愈率的结果相吻合。
表 1 疣粒野生稻愈伤组织的诱导
材料 初始出愈时间 /d 种子接种数 /粒 愈伤组织诱导数 /个 出愈率 /%
成熟种子 2 1 5 0 3 5 7 0
55 ℃处理 3 d的成熟种子 1 5 5 0 4 2 8 4
根据我们的观察, 诱导出的愈伤组织有3种类
型, 第1类结构松软或呈粘胶状且生长缓慢, 第2类
团块结构紧密、多根状突起, 第 3类颗粒细小、致
密而结合松散, 生长迅速淡黄色块状。前两者生长
缓慢, 后者表现出胚性愈伤组织特有形态。同时还
观察到, 继代时在MS培养基中添加 500 mg·L-1脯
氨酸、500 mg·L-1谷氨酰胺和 300 mg·L-1水解酪蛋
白, 并提高琼脂浓度至1.0%时, 对于胚性愈伤组织
的诱导和胚性的保持有较好的作用, 这对形成结构
致密且松散结合的理想胚性愈伤组织来说是有利
的。
2 胚性细胞悬浮系的建立
将颗粒细小、致密而结合松散、颜色鲜艳呈
黄白色、生长迅速的胚性愈伤组织置于液体培养
基AA中培养后, 经过3个月继代, 细胞悬浮物呈细
小颗粒状(
厚, 内含物丰富, 活力强(图 1-b)。用酶液处理 3~4
h, 便可游离出大量有活力的原生质体(图 1-c)。这
表明良好的胚性悬浮细胞系已经建成。
3 原生质体的游离和培养
3.1 原生质体游离时期的选择 悬浮细胞系建立过
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程中, 悬浮培养中期的悬浮细胞大部分呈椭圆形, 并
开始有小部分细胞团形成, 其中心部分的细胞质逐
渐变浓, 而边缘细胞的细胞质仍未充实。采用此期
的悬浮细胞游离原生质体的原生质体产率极低, 且
原生质体内含物稀薄, 包埋培养 2~3 d后, 还有部
分细胞壁未能再生, 细胞内含物易外渗。同时, 这
类原生质体不能持续分裂, 培养 1周后, 细胞逐渐
变空, 胞质环流基本停止, 细胞失去活性。悬浮培
养后期的细胞基本为圆形, 每个细胞团有40~50个
细胞, 胞质浓、内含物丰富、细胞膜光滑。取继
代后3 d的悬浮细胞游离原生质体, 原生质体得率高;
刚游离出的原生质体呈球状, 内含物丰富, 活力强。
3.2 原生质体的游离 从表 2中可以看出, 酶种类、
浓度和酶解时间均会影响原生质体的产率和质量。
纤维素酶单独使用的原生质体产量小于 103个 ·g-1。
纤维素酶和果胶酶配合使用的原生质体产率较高,
本文用2%纤维素酶+0.2%果胶酶+5 mmol·L-1 MES
的酶液可使原生质体的产量达到 2.0×105个 ·g-1。
适当的酶解时间也是影响原生质体产量的重要因
素。酶解时间过短、酶浓度过低, 均会造成酶解
不充分, 从而影响原生质体产率和质量; 但酶解时
间过长, 原生质体产率和质量也会随之下降, 出现
破碎现象。经比较发现酶解 4 h时原生质体的产
率最高, 为 2.0×105个 ·g-1。Zuily-Fodil等(1987)曾
报道, 在酶解后原生质体分离培养时, 植物细胞膜
的脂类物质存在一个损伤修复过程, 若损伤的原生
质体得不到恢复时, 则细胞丧失分裂能力; 李良材
等(1988)也提出, 两步法酶解可避免细胞自发融合,
减小对细胞膜的损伤。我们用 2%纤维素酶+0.2%
果胶酶 +5 mmol·L-1 MES的酶液酶解 4 h的一步法
酶解, 控制原生质体游离的时间, 并及时静置酶解,
可减少原生质体质膜的损伤, 游离出高质量和高活
力的疣粒野生稻原生质体, 这样可以保证细胞壁的形
成和细胞持续分裂。
表 2 酶种类、酶浓度和酶解时间对疣粒野生稻原生质体产量的影响
处理编号 纤维素酶 RS/% 果胶酶Y-23/% 酶解时间 /h 原生质体产量 /个 ·g-1
1 1.0 0 2 <103
2 1.0 0.1 2 <104
3 1.0 0.2 2 <104
4 1.5 0.1 3 <104
5 1.5 0.2 3 <105
6 2.0 0.1 4 1.0×105
7 2.0 0.2 4 2.0×105
图 1 疣粒野生稻胚性细胞的悬浮和原生质体培养以及植株再生
a: 疣粒野生稻悬浮细胞系; b: 疣粒野生稻悬浮细胞镜检图; c: 疣粒野生稻悬浮细胞酶解游离得到的原生质体; d: 原生质体分裂产
生多细胞; e: 原生质体诱导产生愈伤组织; f: 原生质体再生小植株。
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3.3 原生质体的培养 渗透压是原生质体培养的因
素之一, Russel和McCown (1988)报道在原生质体
培养过程中采用每周降低蔗糖浓度0.1 mol·L-1的策
略可以提高原生质体植板率。据此本文也做了渗
透压调整研究。表3结果显示, 在游离原生质体时,
采用 CPW13配制酶液, 渗透压调节剂甘露醇的浓
度为 13% (约 0.71 mol·L-1), 这样原生质体在游离
和纯化过程中处于微皱缩状态, 可以避免质膜损伤
而导致原生质体破裂。原生质体的KM8p包埋培
养基中的葡萄糖浓度为 10% (约 0.56 mol·L-1)时有
利于细胞壁再生, 同时可促进第 1次细胞分裂。在
细胞开始进入第2次分裂时, 将渗透压从10%降低
到 3%, 然后在预分化时期将渗透压从 3%提高到
6%、在分化时期又将渗透压从 6%降低到 3%, 最
后发现细胞分裂频率、植板率、分化率分别由5.2%、
1.8、6.2上升到 9 .8、2.4、8.6。这可能是 6%
的蔗糖有利于促进愈伤组织长成致密的小块和诱导
胚胎形成; 分化时蔗糖浓度降至正常水平(3%)有利
于通过胚状体途径再生植株。
3.4 原生质体再生细胞团 得到的高质量原生质体
表 3 渗透压对疣粒野生稻原生质体培养的影响
处理
游离时期渗 培养初期渗 第二次分裂时期 预分化时期 分化时期渗 再生细胞
植板率 /% 分化频率 /% 透剂甘露醇 透剂葡萄糖 渗剂葡萄糖和蔗 渗透剂蔗糖 透剂蔗糖 分裂频率 /
浓度 /% 浓度 /% 糖总糖浓度 /% 浓度 /% 浓度 /% %
对照 1 3 1 0 1 0 3 3 5.2 1.8 6.2
渗透压处理 1 3 1 0 3 6 3 9.8 2.4 8.6
用琼脂糖包埋培养, 48 h后有 50%以上的细胞质
进一步变浓, 并开始膨大变形, 这表明细胞壁开始
产生。3 d后大部分原生质体形成完整的细胞壁,
4 d后可以观察到第一次细胞分裂, 5~7 d进入第 2
次细胞分裂, 发育良好且能持续分裂的细胞在15 d
左右长成多细胞团(图1-d), 1个月左右长成愈伤组
织(图 1-e)。此时应及时将愈伤组织转入分化培养
基上培养, 45 d后出现胚芽鞘和少量的根, 并再生
出绿色小植株(图 1-f)。
4 植株再生
愈伤组织转入分化培养基上15~20 d后出现绿
点, 并进一步形成幼苗。0.1~0.5 mg·L-1的NAA与
1.0~2.0 mg·L-1 KT有利于植株再生; KT浓度大于
2.0 mg·L-1且不加NAA时, 非胚性愈伤组织容易快
速生长, 但不利于植株分化和再生。此时将 l cm
长的幼苗移于生根培养基(1/2MS+NAA 0.5 mg·L-1)
上, 可以促进根和幼苗的生长, 形成完整的绿色小
植株。
参考文献
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