全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 1期，2004 年 2 月 127
收稿 2003-04-07 修定　 2003-08-25
资助 福建省青年科技人才创新基金项目(2001J043)。
*E-mail:linjiaochen@163.com, Tel:0592-2185695
被子植物离体受精系统的遗传操作
陈林姣* 李爱贞 田惠桥
厦门大学细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室，厦门 361005
Genetic Operation of in vitro Fertilization System of Angiosperms
CHEN Lin-Jiao*, LI Ai-Zhen, TIAN Hui-Qiao
Key Laboratory of Ministry of Education for Cell Biology and Tumer Cell Engineering, Xiamen University, Xiamen 361005
提要 介绍被子植物离体受精系统分子生物学研究取得的重要成果及最新进展。
关键词 精细胞；卵细胞；合子；特异基因表达；转化
被子植物的双受精和随后的胚和胚乳的发育
发生于雌配子的胚囊中，而胚囊又深深嵌于母体
组织的子房中，这使得被子植物的受精机理和合
子发育机制的研究相当困难。因而,以往对这些问
题了解很少。近 10 多年，随着雌雄配子分离技
术的成熟和离体受精的成功，使分子生物学方法
的应用成为可能，特别是近几年来逆转录酶聚合
酶链式反应（reverse transcriptase-polymerase chain
reaction, RT-PCR）技术的发展为研究植物少数或
单个细胞的基因表达提供了一个灵敏、稳定、可
靠的技术和手段。目前，在离体受精技术体系的
基础上，运用分子生物学方法从分子水平研究被
子植物精、卵细胞的发生，雌、雄配子的识别，
合子激活以及早期胚胎发育的文章逐年增多，从
分子水平上揭示了一些被子植物有性生殖方面的机
制问题，反映出这方面的研究非常活跃。本文从
3个方面介绍采用离体受精技术体系开展有关这一
问题的分子生物学研究的最新进展。
1 离体受精
离体受精是指离体的精、卵细胞在离体条件
下融合形成合子。整个离体受精实验体系包括配
子分离、雌雄配子融合、人工合子培养 3 个主要
技术环节。与动物和低等植物相比，被子植物的
雌雄配子被体细胞组织层层包裹着。因此，分离
一定数量并具有生活力的精、卵细胞是成功地实
现离体受精的前提条件。自上世纪80年代中期以
来，分离精细胞技术不断地发展和提高，现已从
数十种植物花粉中分离出了具活力的精细胞[1~3]。
卵细胞的分离起步较晚，且较精细胞的分离困难
得多。胡适宜等[4]最先采用酶解法从烟草中分离出
卵细胞。此后这一方法在卵细胞分离中也被广泛
采用，并先后从蓝猪耳（Torenia fournieri） [5]、
白花丹（Plumbago zeylanica）[6]、玉米（Zea
mays）[7]、烟草(Nicotiana tabacum)[8]等植物中分
离出生活的卵细胞。近年来，分离卵细胞的方法
在不断改进，成功分离有生活力的卵细胞的植物
种类大大增加，尤其是禾谷类作物，如黑麦草
（Lolium perenne）[9]、大麦（Hordeum vulgare）[10]、
小麦(Triticum aestivum ) [11]、水稻（Oryza
sativa）[12]等。在精、卵细胞分离成功的基础上，
Kranz和Lörz[13]首次采用电融合方法获得了玉米离
体受精的成功，并且受精形成的人工合子可经体
外培养发育形成胚，继而再生成可育植株，开创
了植物受精研究史上的新纪元。19 9 5 年,小麦
精、卵细胞诱导融合，人工合子分裂形成了多细
胞团[14]。随后,小麦、水稻离体合子培养再生完整
植株相继获得成功[15,16]。最近，我国一些研究者
对双子叶植物烟草离体受精的研究也进行了一些探
索，并取得了一定的进展[17,18]。
2 雌、雄配子和合子发育过程中的特异基因表达
随着被子植物精、卵细胞分离技术的成熟和
离体受精的成功，对这些细胞进行分子生物学研
究成为现实。Dresselhaus 等[19]以RT-PCR技术为
植物生理与分子生物学Plant Physiology and Molecular Biology
植物生理学通讯 第 40 卷 第 1期，2004 年 2 月128
基础,首次构建了被子植物卵细胞的 cDNA 文库。
Richert等[20]对这一方法作了进一步改进后，可用
于研究单个植物细胞的基因转录和表达，从而克
服了性细胞，特别是卵细胞，数量少的难题。离
体受精技术体系与新的分子生物学技术相结合后，
人们对精细胞和卵细胞、合子、胚胎发育早期的
任何阶段直接进行遗传分析就成为可能。
2.1 雄配子发育过程中的特异基因表达 被子植物
的雄配子发育始于小孢子的不等分裂，形成 1 个
大的营养细胞和 1 个较小的生殖细胞，生殖细胞
进一步分裂产生 2 个精细胞。雄配子（或精细
胞）的染色质高度浓缩，细胞质非常少，一般
认为雄配子细胞的转录是不活跃的[21]。但也有研
究表明精细胞具有转录活性，能合成 RNA 和蛋白
质[22,23]。精细胞在受精过程中有与雌配子识别、
粘附、融合等多种功能，人们推测这些高度特异
化的功能受一组特异基因的激活所控制[24]。在白
花丹和烟草等植物中发现精细胞具二型性
（dimorphism）[25,26]。两个精细胞之间以及精细胞
与生殖细胞之间的基因表达程序是否有所不同,两
个精细胞与卵细胞和中央细胞融合是随机的还是具
有选择性,这些问题都有待从分子水平上找出证
据。Dumas和 Mogensen[27]率先以玉米离体受精体
系作为研究被子植物胚胎发生的实验体系，并尝
试构建了玉米精细胞的 cDNA 文库。Southworth
和 Kwiatkowski[28]、Xu 和 Tsao[29]分别从白菜
(Brassica)、百合（Lilium）和玉米的精细胞上
分离出质膜蛋白（plasma membrane protein），
其中一些可能与精细胞的识别功能有关。Xu等[30]
从麝香百合（Lilium longiflorum）的精细胞中鉴
定出一特异基因（L G C 1 ），其表达产物位于精
细胞表面，推测可能与精、卵细胞的相互作用有
关。Ueda 等[31]从麝香百合的雄配子中分离出3种
核心组蛋白（core histone protein）基因，它们
所编码的蛋白在两个精细胞中含量最高，推测它
们与雄配子的染色质浓缩或重新改造有关，并抑
制雄配子中的基因表达。最近，Xu 等[32]构建了
烟草精细胞文库，从 396 个克隆文库中初步筛选
出2个在生殖细胞和精细胞中特异表达的NtS1和
NtS2基因，发现其中的NtS1编码一个多聚半乳糖
醛酸酶（polygalacturonase），推测这个酶在烟
草雄配子分化过程中的细胞壁降解中起作用。
Singh等[33]构建了麝香百合生殖细胞和白花丹精细
胞的 cDNA 文库，在两个 cDNA 文库中发现各有
一个基因编码相同的多聚泛素（polyubiquitin），
但两个基因的编码区外则有差异。这两个基因的
功能是参与泛素化（ubiquitination），很可能在
两个雄配子的发育过程中调节蛋白质活性。上述
研究对于揭示雄配子发育的分子机制和受精时有关
雌、雄配子的识别过程迈出了重要一步。
2.2 卵细胞和合子发育过程中的特异基因表达 合
子激活是配子体发育转向孢子体发育的一个关键事
件。在动物中，受精前卵细胞中就储藏了受精后
合子分裂所需要的 mRN A，其表达产物的极性分
布形成合子的极性。大多数哺乳动物合子激活发生
于二细胞至十六细胞阶段[34~36]，有些则更晚[37,38]。
相对于动物来说，被子植物合子激活研究起步较
晚，人们对其了解甚少。比较被子植物卵细胞与
合子之间的cDNA文库是了解合子特异基因的有效
方法。Dresselhaus等[19,39]在玉米离体受精成功的
基础上先后构建了玉米卵细胞及合子的 cDNA 文
库，并通过差异筛选分离出若干在卵细胞中特异
表达或由受精后诱导表达的基因。从 104 个离体
受精后 18 h 的玉米合子 cDNA 文库中筛选出了一
种钙网硬蛋白（calreticulin）基因。该基因的表
达产物主要存在于细胞内质网中，在卵细胞受精
后表达增强，与细胞分裂密切相关[39]。这是首次
从被子植物合子中分离出的基因。随后，他们又
从玉米卵细胞和合子的 cDNA 文库中筛选出了 50
多个不同基因，发现未受精卵细胞中储藏有相当
多的翻译启动因子的转录本，这些启动因子可能
与卵细胞中的某些 mRNA 的稳定和翻译有关。一
些基因在受精后18 h内重新表达，其中有7个基
因编码的蛋白可能与转录有关；有 2 个基因是受
精18 h 后开始转录的，其编码的蛋白可能与DNA
的复制和修补有关[40]。一般情况下，合子在受精
后42~46 h发生第一次不等分裂[41]。这暗示被子
植物合子激活发生于合子第一次分裂之前，相对
于动物中合子来说其激活要早许多。Sauter等[42]
对合子的细胞周期调节基因进行了研究。他们分
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析了玉米离体的精和卵细胞、中央细胞、助细胞
及合子的细胞分裂周期基因 cdc2（cdc2ZmA/B）
和细胞周期蛋白cyclin基因的表达，发现cdc2基
因在胚囊中的所有成员细胞和精细胞及合子整个发
育过程中均有表达，而cyclin基因仅在胚囊中特
异表达，且在受精18 h后重新转录，在受精过程
和合子发育过程中呈现不同的表达方式。但
Vielle-Calzada等[43]研究拟南芥的早期胚胎发育
时，发现好几个来自父本的等位基因转录在
32~64 个细胞的幼胚时期才开始。合子的第一次
不等分裂的发生和合子激活的分子机制尚有待深入
研究。但很显然，这领域的研究已从体外受精技
术的探索深入到受精过程和合子激活基因调控的认
识。
3 离体受精体系的转基因
有实验表明，转基因方法适合研究某一基
因在植物发育过程中的作用[44]。玉米[13]、小
麦[14,15]、水稻[16]的离体受精和合子有效的再生
培养体系的建立为开展这方面的研究打下了基
础。采用离体受精实验体系不仅可筛选与受精
过程和合子发育有关的新基因以及揭示其特异
的表达方式，而且可结合转基因技术，研究某
个基因在离体精和卵细胞、合子中的表达水
平，从而进一步分析这一基因在受精过程和合
子发育过程中的功能。
由于分离的卵细胞和合子的数量有限，至今
显微注射法是向卵细胞和合子中导入外源基因的一
种首选方法。Leduc 等[45]在玉米合子分离、培养
成功的基础上首次采用显微注射法向授粉24 h后分
离出来的 227 个玉米合子注射两种报告基因，结
果有3.5%的合子在培养4 d后显示出报告基因的瞬
间表达。Pónya等[46]分别向小麦的98个卵细胞注
射带有泛素启动子的绿色荧光蛋白（green fluores-
cence protein，GFP）基因，向77个合子注射具
35S 启动子的 GUS 基因，两者的平均瞬时表达率
分别为 46% 和 52%，远远高于以它的体细胞为受
体的转化率。其中卵细胞的转化率高低与卵细胞
分离的时间有关，开花前1 d的卵细胞表达率可达
73.91%。而不同时期的合子的外源基因的表达率
没有明显差异。Home 等[47]向分离的大麦合子注
射一种具水稻肌球蛋白启动子的 GUS 基因后，结
果在注射的上百个合子中有 34% 发育为胚状体结
构。PCR 检测显示约21% 的胚状体中有转入的外
源 DNA，但只有少数胚状体有GUS 基因表达。他
们认为外源DNA很可能降解。Scholten 和Kranz[48]
向玉米的卵细胞、精细胞、助细胞、中央细胞
中注射具有 35S 启动子的 GFP 基因后，其中卵细
胞、助细胞、中央细胞呈现 G F P 荧光，而转基
因的精细胞中未检测到。转基因精细胞与没有转
基因的卵细胞融合后，在受精后不久就可诱导外
源基因的转录，合子中可检测到 GFP 荧光。由于
GFP对细胞没有毒害作用和在荧光显微镜下无扩散
效果，因此，他们认为可以此研究离体受精所产
生的人工合子和初生胚乳细胞的发育特征，并可
进一步研究受精后早期发育过程中诸多调节发育的
基因功能，从而从细胞和分子水平上揭示受精过
程和早期胚胎发育的机制。
自1983年首次获得转基因烟草以来，人们一
直在努力探索一种高效的植物转基因方法。一般
来说, 植物基因转化法有农杆菌介导的基因转化
法、P E G 介导的转移、电激介导转移、基因枪
转化以及微注射法等多种外源基因的转化方法。
这些方法在不同的植物类型和组织中有着不同的适
用范围和优缺点[49,50]。目前，在植物基因工程研
究中尚未找到一种高效的转基因方法，仍有许多
技术问题需要解决 ,如受体系统中普遍存在的转基
因沉默、转化频率低、转化的植株后代遗传不稳
定；而且无论是以原生质体、幼胚或愈伤组织，
还是细胞悬浮系等作为转化受体系统都要经过繁琐
的细胞组织培养和植株再生过程，不仅实验周期
长，而且在长期的组织培养过程中，容易产生无
性系变异和造成不育、不孕株，影响转化效率。
植物精、卵细胞分离技术已日趋成熟和完善，离
体受精及人工合子、自然合子的离体培养与植株
再生技术取得了重要进展和突破[51,52]，这些都为
植物转基因研究不断开辟新的途径。精和卵细
胞、合子具有旺盛的生命力，无论是人工合子
或是自然合子，在离体条件下均有很高的分裂
频率，并且基本上都遵循胚胎发育途径再生植
株[13,15,16]。以它们作为转化受体，虽然数量有
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限，但它们在转化率和外源基因在转基因后代
中的遗传表达稳定性方面，都有一般体细胞所
不可比拟的明显优势。此外，由于是对单个细
胞进行遗传操作，并且有较高的转化效率，因
而可以不需用抗菌素基因、抗除草剂基因等作
为筛选的标记基因。目前,在田间试验和被批准
商业化应用的转基因植物中都含有标记基因 ,有
关标记基因的安全性常是科学家和社会广泛关注
的问题。因此，上述的无需标记基因的转基因
体系，在今后的转基因农作物商业化生产中，
将会有巨大的潜在应用前景。
4 展望
采用新的分子生物学技术开展被子植物离体
受精系统的分子生物学研究方兴未艾。合子和早
期胚胎极性是怎样建立的、合子细胞周期的调
控、何种基因参与受精过程、合子激活以及幼胚
发育等问题均已引起人们的极大兴趣。获得精和
卵细胞、人工合子的方法以及从微量细胞构建和
筛选 cDNA 方法已经建立，这些都是上述研究的
技术基础。以合子作为转化受体，具有较高的转
化率，基本能遵循胚胎发育方式再生植株，可以
用于研究特定基因在受精过程、合子激活以及早
期胚胎发育过程的表达和功能。这些技术和体系
使得离体受精体系的转基因研究越来越具有诱惑
力。相信随着研究的不断深入，人们对被子植物
受精过程、合子细胞周期调节以及早期胚胎发育
将会有一个较全面的综合认识，以合子为受体的
转基因途径也将在基因功能研究和农作物改良中得
到广泛应用。
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