全 文 ：四川大李学报 (自然科学版 )
Jo u, . 1 o f S i e h u a n U n vl . l t y aN taur l cS i
e n ce E山 t ol n V o l . 2 7 N o 。 3 1 , 9 0
勺 . . . . . . . 叫巨 , , , , , 钾 . ~一 . . . . . . . . 曰 . . . . . . . .
荆豆 (lU ex eu r叩ae us L . )凝集素 I的
细胞表面受体研究 ’
曾仲奎 吴洽庆
(生 物 系 )
曾光耀
摘 要
从 u l e x e u r o p a e u s L . 种子中纯化的荆豆凝集素 I ( u EH I ) , 不仅专 一 地
凝集人 o 型血细胞 , 也能凝集牛精细胞 , 表明这些细胞表面存在有 u EH I 的受
体 . 应用经 F I T C 或 1补I 标记的 U E H I 与牛精细胞结合 , 研究受体在精细胞表
而的分布 , c l e 、 e o n A 、 p H A 和 F u 。 的浓度对 , 2 ” I一 u E H I 与 。 型血细胞 结
合的影响 , O 型血细胞和牛精细胞与 12 5 I U E H I 的饱和实验 , 获得饱和结合曲
线或竞争性结合曲线 , 得出各自的 S ca t hc a dr 图 , 分别计算出 O 型血细胞和 牛
精细胞表面的 U E H I 受体的数目 .
关健词 凝集素 , 荆豆凝集素 . 受体 , 牛精细胞受体 .
在文仁1一 7劲勺基础上 , 报道从荆豆种子中分离纯化的荆豆凝 集素 I ( u E H I ) , 分 别
用异硫氰篆荧光素 ( PI T C ) 和 ’ 2 , I 进行标记 , 研究牛精细胞或人 0 型 血细胞上的 u E H I
受体的分布 、 性质和数量等结果 .
1 材 料 和 方 法
新鲜正常人红细胞 ( A B O ) 得自中国医科院成都输血研究所 . 红 细 胞 用 p H ` . 凡
0
.
2m of / L 磷酸缓冲液 ( P B S ) 洗涤 3 次 , 冰箱保存备用 . 牛精细 胞 得 自 四川省家畜冻
精液中心站 . 荆豆 ( U l e x e u r o p a e u s L , ) 采 自四川省 城 口 县 . S o p h a d e x G 一 5 0 、 G 一 2 0 0
购自 p h a r m a e j a ; N 一乙酞半乳糖胺 ( G a l N A e ) 、 伴刀豆 球 蛋 白 ( C o n A )购 自 S i g m a ,
L
一岩藻糖 ( L 一 F U C ) 购自 S 艺 r y “ ; N “ ’ 2 ; I 为 中 科 院原子能研究所产品 . 其余试剂为分析
纯或化学纯 .
1 u E 卜1 1 的分离纯化 按 M a t s u m o t o 等川的方法 进 行 . u E H I 经 p H S . 9 , t r i s -
E D T A N a Z
一
b o r a t e 缓冲液聚丙烯酞胺凝胶电泳为均一乖丫,昂 , 用 S e p h a d e x G 一 2 0 0 测定 其
分子 屠为 1 7 0 , 0 0 d .
2 血球凝集作用 取 U E H I 溶液 (l m g /m L ) 用等体积的 P B S 在 微量稀释板上进
行二 倍系列稀释 , 加入 2 %的血球悬浓 , 振摇后室温 (2 ,℃左右 )放置 功 , 显微镜 下 观
察 其凝集情况 .
3 牛精细胞的凝集实验 取经镜检活力强的牛精细胞 , 用 无 糖 B ak er ` s 液 稀 释
至适 当浓度 , 3` c 保温备用 . 在微星稀释板上将浓 度 为 l m g / m L 的 u E H 1 2匆 L 经 二
本文于 1 9 5 5年3月2 5至」收到
带 国家自然科学基余资助项口
第 3期 曾仲奎等 : 荆豆 ( U e lxeu o r pae u s L.)凝集素 I的细 胞表面受体研 究 3 7
倍系列稀释后 , 加 入备用的精细胞 2印L , 振摇 、 3 6℃温育 2 小时后 , 制片 , 于倒置 显
微镜下观察 , 照相记录 .
4 荧光标记及牛精细胞表面 u E H I 受体的分布实验 了{ 一低温 4℃用透析法标记 〔’ 了.
获得 IF T C 一u E H 1 . 将己稀释备用的牛精细胞涂布于载玻片上 , 待干后 , 再涂布 F IT C -
U E H I , 3 6℃ 保温 i 竺m i n , 加盖片 , 置 o p T o N 一 1 0 荧光显微镜下观察 , 照相记录 .
5 U E H
一
I 的 ” 5 1标记 按前报道的方法 ! ’ 1用氯胺 T 法进行氧化反应 . 反 应 终 正
后加入 1% K l 至 营、体积为 弘 〔吐 , 取 扭 L 测标记 率 , 其 余 溶 液 经 eS p h ad e x G 一如 ,
p H 7
.
4 , 0
.
l m ol / L P B 溶液洗脱 , 分部收集 , 流速为 。 . 6m L /分 、 管 . 用 F H 一 4 8D 自 动
定标器井型探头测定 ( 30 “ ) , 向放射性最高的第一峰的收集管中加 入 1% P S A 。· 6m L ,
再取出少量加三氯醋酸沉淀 , 离心后测放化纯度 , 其余 ` 2 51 一 u E H I 冰箱保存备用 。
6 细胞浓度对结合率的影响 取不同浓度的 0 型血细胞 0 . 2m L , 分 别 加 入 ’ “ 51 -
u E H 1 o
.
0 5m L
, 用无糖 H a n k , s ( D 一 H a n k ` s ) 液补加至总体积为 0 . 4m L , 2 6℃ 温育 l h ,
测总脉冲数和洗涤后沉淀的脉冲数 , 以二者之比求得结合率 , 再以细胞浓度为横坐标 ,
结合率为纵坐标作图 。
7 单箱或外源凝集素对 ” 可 一 U E H I 与 o 型血细胞结合的影响 于系列小试 管 内
分别加入 o 型血细胞 0 . l m L (2 . g x 1 o ’个加U , 或 经 二 倍 系列稀释的 D 一甘露糖 ( D -
M a n )
、 或 D 一葡萄糖 ( D 一 G l e ) 、 或 I 一 F u e 、 或 D 一木糖 ( D 一 X y l ) 、 或外源凝集素 C o n A 、
或 p l { A 、 或 B S A 、` . l m T一 , 分另I}混匀 , 2 () ℃ 预温 Z Cm i n , 加入 ’ 2 51一 U E H 1 0· l m L , 温 育
6 0m in
, 测总脉冲数及沉淀洗涤后的脉冲数 , 求得结合率 , 再以空白结合率为 1。。% , 求
得相对结合率 。
8 饱和实验 于小试管内分别加入 0 型血细胞 ( 2 . 9 X 扣 ’个 / m功和牛精细胞 ( 弓. 6弓
又 I C6个 / m L ) 各叭 Zm L , 加入不同量的 ’ 2 51一 U E H I , 补 加 D 一 H a n k ` s 液 至 总 体 积 为
。 . 4 m l , 1小时后 , 用 FT 一 6昭 自动计算 ’ 2 51 放 免 测量仪测得总脉冲和沉淀洗涤后的脉
冲数 ( 均为比 ) , 求得结合量 , 并据此对加入的 ’ “ 51一 u E H I 量进行半对数作图 .
g 未标记的 u E H I 对 ’ 2 51一 u E H I 与 O 型血细胞结合的影响 于小试管 内分别 加
入 。 型血细胞0 . l m l , 加入经二倍系 lyJ 稀释的 u E H I (〕. i m L , 2 6℃ 预 温 1 , m i n , 再分
别加入 ” 51一 v E H 1 0 . i m L ( 0 · 4 1 4拼g ) , 2 6℃保温 l h , 用 F l 一 6 ( 3 放免测量仪测总脉冲 和
沉淀经洗涤后的脉冲数 ( 6 5 ) , 求 得结合率 , 对加入未标记的 u E F I 量作图 。
2 结 果
1 u E H I 对人 A 、 B 、 0 型血细胞和牛精细胞的凝集结果见表 1和图 1 .
2 u IE 理 I 经 IF T C 标记后其凝集活性不受影响 . IF T C 一 U E H I 在荧光显微镜 下 产
生黄绿色荧光 , 与牛精细胞作用后的结果见图2 。
3 u E H I 的 ` 2 51 标记 氯胺 T 氧化法对 U E H I 进 行 ’ 2 51标 记 后 , 经 S e p h a d e x
G
一
5 0 (2 s x lc m ) 分离纯化 , 结果见图 3 . 前峰为 ’ “ SL U E H I 峰 , 后峰为盐峰 。 经计 算
其标记率兰 3 2 . 习% , 放化纯度为 9 8 . 6% , 此放射性为 2 . 4拼iC 邝 9 .
4 细胞浓度对 ’ 竺51一 U E H I 与其受体结合的影响见图 4 . 当细胞浓度增 加 至 1。 网个 /
m L 时 , 其结合 率不再发生明显变化 。
3 3只 四 川大学学报 (自然科学版 ) 第 27卷
表 1 UE H I对人血球和牛精细胞的凝集作用
细 胞
0一型
A 一塑
E一型
牛精细胞
凝集素浓度 (拼g /m L)
l
。
25
5 0 0
4 O
1
。
5 2
麒熟奢君锐彝…
图 1 UE H I对牛精细 胞的凝集作用
(5 X 4 0)
图 2牛情细胞表面 P ITC 一 UE H I受体
的分布 ( X 8 0 O)
心丫 .一 n
甘 0口才之户、 .
(欲à泊从加
O川 \卜一几备ó T汉
J I尸 里
01 0卫 O
分部数
0 3日 O0 8
纽和浓亥 (
1小 夕 4 2 3
“ j o` 之 l丫m L夕
图 3’ 5 21 一 E UH I在柱上的层析图 图 4
反应系统 : 0.
细胞 浓度的影响
Zm L不同浓度的红细胞十 0 .s Om L
1 251
一
UE H I+D
一
Ha nk
, s 溶液 0 . 1 5m L ,
保温 6 0m i n , 2 6 “ C . B : 结合率
5 不同浓度的单糖对 ’ 2 51一 U E H I 与 0 型血细胞结合的影 响 见 图 弓. 由 图 可 见
G a lN A
。 对其影响不大 , 但 lG c 的 浓度 由 10 一 sm ol / L 上 升 至 I -C ` m ol / 1 , 其相对结合
率急剧下降 (幼 %下降至叨% ) , 而 L 一 F cu 和 D 一 X y l 不论 日:浓 }勿均变化多大 , 具相对结
合率均无明显变化 .
6 外源凝集素对 ’ 2 51一 U E H I 与 o 型血细胞结合的影响见图 6 . 从 图中看 出 P H A
和 C o n A 的浓度由 0 · l m g /m 毛 增加 到 1(’ m g / m L 时 , 其相对结合率分别从 94 %和 74 %
下降到 4 0%和 2 6% , 尤以 P H A 影响的幅度较大 .
7 饱和实验 不同量的 ” 51一 u E H I (浓度为 4 . 14 补g / m L ) 与 o 型血_细胞或牛精 细
胞的结合曲线分别见图 7和图 8 . 两者均为较规则的 “ S’ , 形曲 线 , 此 “ S’ ’ )阵 月n 线 表 明
` 2 5 1一 U E H I 与 O 型或牛精细胞的受体结合对 u E H I 而 言 , 都是 一 个饱和过程 . 据图 7
第 3期 曾仲奎等 :荆豆 ( Ul oxe u r opa ou sL . )凝集素 I的细胞表面 受体研 完 3( ) 3
冲为叼、贫琴言’ .。 {、
` ”一
“ 卜汗二下 一干
10
一 ` 10一 10一 3二匀 -
桔浓度 M ( )
飞 ,
二0 “ 止 O
不今续专贵
1汀 豆之
比 困广 幼
图 5 单糖对 ` “ 5卜 U E l l 与 0 望 互纳
胞 结合的影响
反应系统 : 0 . 1m L O型 血细饱 十 r户糖。. h n L
+ 12 5 I U E H 1 0
。
l m L
. 对照 ” 1二) 1 1` :飞{、 ’ S液
代替糖溶液 .
G a IN A c
. . . . . . · · · , · · … … C l : 一 - · - 一 · 一
M
a n -
-
-一一一一一一 D X 上 l - - - - - - - 一
L F u c一 · · 一 ” 一 ” 一
阅 臼 凝集素衬 ’ ”5卜 U E H I 与 0 型血细
胞 结合的影 。 :二〕
反应系统 : 。 . l m L O 型血系细胞 汗一 0 . l m L凝集素+
, “ 、 1 U E卜, 1 0 . l m L . 对照用 D 一 H a n k , s 液代 替
凝集素溶液 .
儿乏A 一 - · - 一 · 一 P H A - - - 一 C o n A—
/…一厂以0ō冈沈à门
一一 -司匕 一石一一J ` 0 Z tl o 一 _ ~ J一三口口一( 汉 1 O t , g ) / (2 . : ` , L ’ 亡, 卜 U l 二2 1 -
立9
七J 了: 沪/ / Q · 产 : 几二-
图 7 1 ’ 51一 u E 日 I 和 0 型细 饱的结 合曲 线
反应系统 : 0 . Zm L O 型 血细 胞 , 不同 .获的
1 ? S I U E川 , D 一 * J a n k ’ s ) rl二i龙总沐积为 0 . 4 ; 、 I L .
B : 为结介坡
图 8 ’ 2 5 1一 U E H I 和牛精细饱的结 合 曲线
反应系统 : 牛精细胞。. 2m L , 不同 准的 仪 5艺
u E川 , D * s a n k , s 液加至总体积为。 . 4 n 、 1 .
B
: 为结介狱
尸 z / 尸备 一二
一 上_ 」_
|卜一J, ,志éó ù铂
L 、 户豆。 )
图 9 S e a t e h a r d 月
从 结合量 :;l 洲一离虽
、 J _ O
石( 沐 1 0 一 岁二吕)
一ùù .洲孟·自ù一ì去ùù 户é一,
/一
图1 0 S e a t e h a r d 图
B
: 结合量 F ; 游离量
34 0四川大学学报 (白然科学版 )第 2,卷
和图 8得 S e a t e h a r d 图 9和图 l o t` ” 1 . 从图 r卜.可见两类细胞的 S e a t e h a r d 图均不规则 , 提 示
两类细胞膜上的 u E H I 受体是比较复杂的 , 似乎不能用简单的动力学方式来表达 .
根据图 7和图8 , 可 以得出两类细胞的 饱 和 结 合 量 , 分别为 0 。 36 4拼g 和 (4 8 . 53 x
10
“ 4 )环g , 按下式计算出结合容量 :
结合容量 = B (拼g ) x 1 0
一 “ x 6 。 ( 2 x l 乞艺弓`
M
.
w (凝集素 ) x 细胞个数
O型细胞结合容量 0
。
3 6 4 K I C
一 “ x 6
。
0 2 火 1 0 2 3
1 7 0 , 0 0 0 x Z
。
9 K 1 0 7
= 4
.
4 4 x 1 0 4个 /细胞
牛精细胞结合容量 4 8
。
5 3 x 1 0
一 4 K 1 0
一 “ 又 6 。 0 2 火 1 0 2 3
1 7 0 , 0 0 0 x 5
.
6 5 片 1 0 7
= 3
.
0 4 x 1 0 4个 /细月包
式中 B 为结合量 , 170 , 0 0 0为 u E H I 的分子量 .
8 未标 记的 u E H I 对 ` 251一 U E H I (浓 度为 .4 1 4阳 /m )L 与 O 型血细胞的竟争性结
合实验结果 , 根据以结合率对加入未标记的 U E H I 的量作 图 石川得 图 1 , 再 据 图 1 得
s e a t e h a r a 图 1 2 . 从图 1 2可见 `“ 51一 u E ll l 与红细袍的结合量随未标记的 U E H I 量 增 加
而下降 . 按张新堂等的方法 毛川据图 1 2也可计算出 0 型 血细胞表面的受体数为 :
受体数
_ 每升 u E H I 结合 克分子数
每升细胞数 x 6
。
0 2 x 1 0 2 3
二丝丝旦宜嘿昂欲 i李卫丝些 = 3 · 2 2 “ 。 4个 /细胞
十泣
一印介少了山
,
:么
, ~ 曰目. . . ` - 一 ~ , ~ 二一 ~ 占一J介 一 、 l 口、 ; 色夕
图1 1 U E H I 时 1 2 51 一 U E H I 和红 细胞
的竞争性结合曲 线
反应系统 : 红细胞。. l m L , 不同浓度的
U E I王1 0 。 1m L , 1 : 51一 U E H 1 0。 l m L
( 0
。
4 14拜g )
又甲二 : 几 , )
图 1 2 S o a t e h a r d 图
:B 结合量 f ; 游离量
3 讨 论
U E H I 是对人类 0 型血较为专一的凝集素 , 当 浓 度 为 1 · 2 5m g / L 时 , 0 型血 细
袍即可发生凝集反应 , 故在鉴别 0 型血时非常有用 . U E H I 浓度 在 王. 2 5m g / L 时能凝
第 3期 曾仲奎等: 荆豆 ( u l。 、 。 ur op aet s lL . )凝集素 1的 、、 胞表面受体 研 完 34 )
集牛精细胞 , 其凝集类型为头对 7: 的凝集 ( 图 1 ) . 从图 2 中一可以看出牛精 细 胞面表 的 ·
u E H I 受体主要集中分布在颈部 , 而顶体区较少 , 故其颈部呈现荧光亮区 , 这与前报道
的不同凝 集素在牛精细胞表面受体的分布区域各不相同的结果相符 , 如不 具血型 专一性
的三齿草藤凝集素其受体集中分布在顶体区 : 9 〕, 具 A 型 血, 专一的野花生豆凝集素 其 受
体则集中分布在顶体区和核后区 `” { , 而 u lE l l 为 0 型血专一 l均凝集索 , 其受体主要分
布在颈部 . 不同种属动物的精细胞膜 _ :.I 受体的分布也不相同川 , , ` 1 .
用氯胺 T法进行 U E H I 的 ’ 2 51标记 , 只要氧化时间和反应温度控制得当 , 不仅标记
的凝集素不会失话 , 而且其标记率和放化纯度都 可达到高值 . ` 2 51一 u E H I 的生物活性经
测定与未标记者完全一样 , 标记后经 eS p h ad o x G 一知 柱分离前峰 为 ` 2 5 1一 u E H I , 后峰
为盐峰 、 影响 ` 2 5工一 U E H I 与 o 型 血细胞结合率的主要因索是细 ! {包浓度 , 根据细胞 浓度
对 ’ “硕 一 U E H I 与其受体 均结合曲线 , 选择实验巾最佳浓度 在 10 6一 1 0 8个 / m L 条件下完
成以下实验 .
` 2 51一 U E H I 与 o 型血细胞表面受体的结合受某些单糖或其它凝集素的响 影 , 当 单
糖或凝集素浓度增加时 , 其相对结合率可 急 骤 下 降 , 如 G lc 、 lP { A 或 c o n A 即是如
此 . 但是 , 若果单糖是 u E H I 的拍J制塘 , 通然它 !yj 浓度增高 , 对相对结 含率 也几 乎 无
改变 , 这可能表明由于抑制糖分子始终占据 U lE l l 分子上的结合位点 , 致 使 相对结合
率不发生改变 . P H A 或 C o n A 影响其相对结合率 , 可 能 是 lP l A 或 C o n A 与 U E H I
竞争 0 型血细胞上的同一受体所致 .
从饱和实验看出 , 无论是 0 型还是牛精细胞 , 都获得 “ S’ , 形饱和曲线 (图 7 、 8 ) ,
由此得到的 sc at c h a dr 图都 是不规则的 , 这提 示两类细胞膜上的 U E H I 受休并非 单 一
受体 . 根据图 7 、 8 的饱和结合量 , 用 “ 一点分析法 ” 对两类细胞表面 的 U E H I 受体数
目初步进 行计算 , O 型 血细咆 .YJ 受体数为4 · 4 4 火 1甲个 /细饱 , 牛精细咆为 3 . 04 x 1 04 个 /
细胞 . 利用竟争性结合实验的 cS “ thc a dr 图进行细泡表面受体数 目计算 , o 型 血细咆的 ·
U E H I 受体数为3 · 2 2 x 10 4个 /细饱 , 这与 “ 一点分析法 ” 的结果相符 .
从 K卯h l e r ! ` 3 1、 S h a r o n等 [` 5 1的报夕互, 一可以看出 , 不 I司类型的细 jJ包由于其功能 J’ ;勺不 {、己,
膜上受体的种类和数量有很大差异 , 而且处于不同发育阶段或功能状态的细咆 , 膜表 面
受体也不 相同 · 本文所得的两类细胞的受体数较之于其它功物精细胞或人红细胞要低 ,
其可能原因是细胞来源的种属和凝集素的性质 各不相同所致 . 目前研究细胞表面凝集素
受体的报道较多〔“ 一 2“ 〕 , 但研究中所使用的凝集索种类为数不多 , 而应用具有 o 喂 血. 专 、
一的凝集素对 O 型血细胞和牛精细胞表面受体进行研究 , 尚未见诸于报道 .
参 考 文 献
M a k e l a o
。 ,
A n n
.
M e d
.
E x p t l
.
B i o l
.
F e n n
.
3 5: S u P p l
.
1 9 5 7
,
1 1
: 1一 1 33 .
S h a r o n N
.
a n d L i s
, 蚤1. , S e i e n e e . 1 9 7 2 , 1 7 7 : 9 4 9一 9 5 7 .
D c s a i P
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R
.
a n d S p r i
n g e r
,
l
子 .
M e t h o d s i n E n
z y l o l o 吕y . 1 9 7 2 , 28 : 3 3 3一 3 8 8 .
M
a t s u m o t o 1
.
a n d o s
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, 『
r
.
B i
o e h im
.
B i o p h y S
.
A o t a
,
1 9 6 9
,
1 9 4 : 1 8 0一 1 89 .
Il o r e j s i V
.
a n d K o e o u r e k
,
J
.
B i o e h i m
.
B i
o p h y s
.
A o t a
,
1 9 7 4
,
33 6
:
32〕一 3 3 7 .
B l u m b e r g 5
.
e t a l
,
B i o e h im
.
B i o p h y s
.
A e t a
,
1 9 7 2
,
24 6
:
1 7 1一 1 7 6 .
M a t s
Ll m o t o 1
.
a n d o s a w a
,
T
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B i o e h e m i s t r y
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1 3 : 5 8 2一 5 8 3 .
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门IJ
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J
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9
: 1 24一 1 28
S T U D Y O F T H E C E L L S U R F A C E R E C E P T O R F O R T H E
U L E X E U R O P A E U S L E C T IN
Z e , , 9 Z h o 刀 g 天,` 1 W u 口i a q i n g Z e n g G材 a n g 夕a o
(D
e p a l
`
t m七 n t o f L i o l o g y )
A b S T R A C T
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一
H s p e o i f i e h e m a g g l u t i n i n 11 a s b e e n i s o l a te d f r o m t h e s e e d s o f U l e x e u r o p a e u s L
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s护r m ’ 5 s u r f a c e “ r e 、 ’ c r y c o , n p l i c昆 t e d .
K e y W o r d s L e e土i n
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U l e x e u r o p a e u s l 己e t i n , R e e e p t o r , C a t t l o s p e r m r o e e p t o r
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