全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 4期，2004 年 8 月 483
萝卜总 RNA 提取与 mRN A 差异显示技术
黄浩1,2 柳李旺1,* 龚义勤1 陈崇顺2 宋贤勇1 朱献文1
1 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，园艺学院，南京 210095；2 南京师范大学生命科学学院，南京
210097
The Total RNA Extraction and mRNA Differential Display Technique in Radish
(Raphanus sativus)
HUANG Hao1,2, LIU Li-Wang1,*, GONG Yi-Qin1, CHEN Chong-Shun2, SONG Xian-Yong1, ZHU Xian-Wen1
1National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, College of Horticulture, Nanjing Agricultural University,
Nanjing 210095; 2College of Life Science, Nanjing Normal University, Nanjing 210097
提要 以萝卜幼小花药与叶片为材料，初步建立了 mRNA 差异显示技术体系。4 种提取总 RNA 方法中，改进的 SDS/ 酸
酚法比 CTAB/ 酸酚法和 SDS / 碱酚法更合适；改进的热硼酸法(HB)提取的 RNA 质量也较高，但所需时间较长，成本较
高。以改进的 SDS / 酸酚法获得的 RNA 进行纯化后，其 OD260/OD280 在 2.0~2.2 之间， 表明 RNA 样品杂质较少；总 RNA
进行反转录与差异显示分析表明，高分辨力的 cDNA 片段在 100~380 bp 之间。
关键词 萝卜；差异显示技术；基因表达
收稿 2003-12-29 修定 　 2004-04-19
资助　 国家自然科学基金(30300238)、江苏省自然科学基金(创
新人才BK2004418)、上海市科技兴农重点攻关(农科攻
字 1-4)项目。
* 通讯作者(E-mail:nauliulw@njau.edu.cn, Tel: 025- 84395563)。
基因表达的变化是调控生命活动过程的核心
机制。近年来，与发育相关的基因分离克隆已成
为生命科学领域的研究热点之一。鉴别、克隆发
育基因有多种策略，如减法杂交、cDNA-AFLP、
RDA、ISSH、cDNA 微阵列等。Liang 和 Pardee[1]
创立的mRNA差显技术(differential display reverse
transcription PCR，DD-RT-PCR)除成功地应用于
动物及人类多种疾病与重要器官发生有关基因的鉴
定克隆外[2]，也已成功应用于植物果实发育、信
号转导、植物抗逆与抗病性、胚胎发育、形态
发生等有关基因的分离与克隆中，如水稻凝集素
基因表达、番茄果实膨大、小麦春化、水稻胞
质雄性不育以及杂种优势相关基因等[3~7]。
目前，有关萝卜分子生物学研究相对较少，
尚未见到萝卜 mRNA 差异显示技术的报道。已有
研究表明，以 m R N A 与总 R N A 作模板，差异显
示结果差别不大[8]。本文以萝卜叶片和花药为试
材，通过筛选合适的 R N A 提取方案，建立起较
完善的萝卜 mRNA 差异显示技术体系，从而为开
展萝卜重要园艺性状的分子鉴定与功能基因的分离
克隆奠定基础。
材料与方法
实验材料为晚抽薹萝卜(Raphanus sativus) 细
胞质雄性不育系(CMS)的保持系(本研究室培育)鲜
嫩叶片和花药。
所有试剂均为新开封或经焦炭酸二乙酯
(DEP C)处理过的专门用于提取 RNA，经高压灭
菌。提取缓冲液为0.5 mol·L-1 Tris、5 mol·L-1 NaCl、
0.5 mmol ·L-1 EDTA、1% SDS、2% b- 巯基乙
醇， pH 8.2。玻璃器皿于180~200℃下烘8 h左
右，塑料器皿用 DEPC 处理灭菌后一次性使用。
提取 RNA 采用 4 种方法。SDS / 酸酚法参考
文献 9 的方法并略作修改，具体操作流程为：取
200 mg左右的萝卜叶片和花药，加液氮迅速研磨
成粉状，移入2.0 mL离心管中，加600 mL RNA提
取缓冲液、等体积酸酚、1/4 体积氯仿、15% 无水
乙醇、少量聚乙烯吡咯烷酮[PVP(K30)]，混匀并剧
烈震荡4~5 min，静置15 min；4℃、12 500×g 离
心 15 min；取上清液加入等体积酸酚，1/5 体积
3 mol·L-1 醋酸钾(KAc)，剧烈震荡4 min 后，加
入等体积氯仿，混匀；离心后取上清液加入等体
积氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液，混匀后再重复抽
提1次；离心后取水相加入2.5倍无水乙醇和1/10
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体积3 mol·L-1 NaAc，混匀，-20℃放置2 h以上；
4℃、12 500×g离心 15 min，弃上清液用70% 乙
醇洗涤沉淀 2次；室温干燥后溶于 20~50 mL H2O
(经 DEPC 处理)中，-20℃以下保存备用。其他 3
种方法为改进的热硼酸法[10]、CTAB/ 酸酚法[11]与
SDS/碱酚法 [12]。取2 mL在1.5%琼脂糖凝胶上电
泳，检测 R N A 完整性。
总 RNA 中 DNA 消化参照 TaKaRa 公司操作指
南进行，再用 BACKMAN DU-640 核酸 - 蛋白分
析仪测定 OD260/OD280，确定 RNA 浓度与纯度后，
调至 1 mg ·L-1；反转录时，每个 RNA 样品，对
应一个简并的寡脱氧胸腺嘧啶核苷酸[oligo(dT)]锚
定引物。取4 mg 不含 DNA 的 RNA，参照 Promega
公司操作指南进行反转录，反转录的 cDNA 用于
DD-RT-PCR 扩增。扩增反应体系为 20 mL，其中
含2 mL 10×扩增缓冲液、0.2 mL 10 mmol·L-1dNTP
混合液、2 mL 10 mmol·L-1对应的简并oligo(dT)锚
定引物、1 mL cDNA、1 U Taq DNA 聚合酶、5
mL 2 mmol·L-1 随机十聚核苷酸引物，双蒸水补足
体积。于PTC-100 PCR仪(MJ Research Inc.)上进
行扩增。反应程序：94℃ 2 min 预变性；94℃
30 s，40℃ 2 min，72℃ 30 s，40个循环；72℃
7 min，4℃保存。
扩增产物在 6% 变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)
上高压电泳，凝胶板用 10% 冰乙酸固定，然后用
超纯水清洗胶板1 min，于染色液(1 g·L-1 AgNO3、
0.056% HCOH)中进行染色(银染方法参照Bassam
等[13]的方法)。经过染色的凝胶板用超纯水洗涤后
显影(30 g·L-1 NaCO3、0.056% HCOH、4 mg·L-1
NaS 2O 3)，待条带清晰，取出固定，室温下自然
风干并摄像保存。
实验结果
1 萝卜叶片与花药总RNA 提取
萝卜组织尤其是花药含有较多的酚类和多
糖，给 R N A 提取造成了困难。本文用 4 种方法
提取的总RNA非变性琼脂糖凝胶电泳的结果(图1)
显示，采用改进的SDS/酸酚法提取的叶片和花药
RNA 中，可以清晰地看见 3 条主带 28S、18S 与
5.8S RNA，28S 约为 18S 亮度的 2倍，且带型清
晰，说明完整性好[14]，同时可见DNA (图 1-a) ；
采用改进的热硼酸法提取到的叶片 RNA 可见多条
带，且主带清晰，表明总 RNA 质量较好(图 1-
b) ；在以 SDS/碱酚法所获得的RNA加样孔附近，
多糖和蛋白很多，RNA 拖尾现象明显，说明结
果并不理想(图1-c); 采用CTAB法所提取的RNA样
品可见到 2 条主带，但较模糊，表明 R N A 已经
降解(图1-d)。
参照样品 R N A 提取所需时间、纯度、产率
等因素，确定采用改进的SDS/ 酸酚法获得的RNA
进行差显分析。总 RNA 经 DNase Ⅰ消化后，以
UV- 分光光度计测定浓度和质量，其 OD260/OD280
在 2.00~2.20之间，产率为177~246 mg·g-1(FW)，
说明样品中的蛋白质或杂质较少；叶片中的 RNA
产率高于花药。琼脂糖非变性凝胶电泳的结果(图
2 )也表明，纯化后的总 R N A 条带完整、清晰，
适合于下一步的逆转录与差显分析。
图1 不同方法提取的RNA
a.改进SDS /酸酚法(3、4为1、2的5倍稀释); b.热硼酸法; c. SDS /碱酚法; d. CTAB/酸酚法。
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胶上进行高压电泳，银染后，可以显现出较清晰
的条带(图 5)。图中每个泳道均为一个引物组合。
对于多数引物组合 cDNA 片段带型清晰。分子量
标准与测序分析表明，高分辨力的 cDNA 片段一
般都在100~380 bp之间；不同引物组合之间带型
不同，反映了不同基因的差异表达。
讨　　论
与其他发育基因分离技术相比，由Liang 与
Pardee[1]创立的 mRNA DD-RT-PCR 技术有许多优
点。能否提取到完整和高质量的 RNA 是差异显示
技术成功应用的关键环节之一。从植物组织中提
取 RNA 有许多方法[9~12,14]，但由于植物基因型的
差异和组织特异性，常造成细胞组分不同，因而
不同材料的 RNA 所采用的提取方案会有所差别。
本文采用 4 种 RNA 提取方法，从萝卜花药和
叶片中提取总 RN A。获得 RN A 样品的时间，改
进的SDS/酸酚法为7~8 h，改进的热硼酸(HB)法
为 20 h 左右，CTAB/ 酸酚法 15 h，SDS/ 碱酚法
24 h以上。因此，从防止外源RNase污染角度来
说，改进的 SDS/ 酸酚法比较适合于萝卜 RNA 的
提取，可以保证其完整性。再就试剂成本来说，
改进的 HB 法中使用的二硫苏糖醇(DTT)、脱氧胆
酸盐与蛋白酶K价格较高，而改进的SDS/酸酚法
最低，这在决定采用何种方法时，也是应当考虑
的。
植物次生物质的有效去除对高质量 RNA 的获
得至关重要。改进的SDS/酸酚法中使用的还原剂
2 mRNA DD-RT-PCR 分析
根据在 UV- 分光光度计上的测定结果调整合
适浓度(1 mg·mL-1)进行反转录获得cDNA(图3)。随
机选用4个差显随机引物与2个锚定引物的引物组
对 RNA 样品反转录产物进行 PCR 分析，扩增产
物经琼脂糖凝胶电泳检测(图 4)后，于变性PAGE
图2 纯化后的花药不同浓度RNA(改进的SDS /酸
酚法提取)电泳图谱
图3 合成cDNA的电泳图谱
图4 部分 DD-RT-PCR产物琼脂糖电泳图谱
图5 不同引物组合差显分析
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b- 巯基乙醇和螯合剂 PVP 可防止酚类化合物氧
化。此法还可采用结合低浓度乙醇和醋酸钾措施
去除多糖，再加入酚和 SDS 等，使 RNase 失活
后进一步用酚和氯仿抽提去除。改进的 HB 法和
CTAB / 酸酚法所获得的 RNA 经琼脂糖胶电泳检
测，所含 D N A 量少，但是 H B 法的 R N A 产率不
高，操作条件要求严格，而 CTAB / 酸酚法所得
的 RNA 则会严重降解。SDS/ 碱酚法不能有效解
决多糖等污染问题。尽管改进的SDS/酸酚法所提
取到的 RN A 样品中也含有 DN A，但这可在后续
的步骤中加以去除。总之，改进的 SDS/ 酸酚法
所需费用低，简单快速，可以考虑作为提取萝卜
R N A 的首选方案。
引物浓度与合理组配也是DD-RT-PCR 取得成
功以及降低假阳性的关键。已有报道中的锚定引
物多为1 mmol·L-1，少数用2.0和2.5 mmol·L-1 [1, 15];
而随机引物浓度差异较大，有 0.2、0.12、0.8、
0.5 mmol·L-1 [1,6,15,16]。本文选用0.5 mmol·L-1的结
果较清晰。已有报道中使用的dNTPs 浓度有0.2、
0.1、0.02、0.01 mmol·L-1以及2 mmol·L-1 不等[1,6,12,16 ]，
本文则是以0.1 mmol·L-1扩增效果为最佳。浓度降
低时，带型会变得极淡或扩不出；浓度太高背景
又会过深。
多数差异显示分析中应用同位素，本文用的
P A G E 胶银染法[1 3 ]，快速、安全、简便，显色
程度容易掌握，只要将显色液充分预冷就可获得
高清晰的结果。在性状表达差异分析中，得到差
异 cDNA 后，即可回收目的片段、克隆测序、验
证，再采取一定策略获得 cDNA 全序列。本文中
通过 PAGE 胶分离、银染获得的比较易辨的 cDNA
片段一般都在 100~380 bp 之间。为进行高效克
隆，应进一步提高扩增效率，优化 PA G E 电泳，
以获得较大的片段。
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