全 文 ：植物生理学通讯 第 41卷 第 1期，2005年 2月 73
马蹄金子叶原生质体的分离技术
严寒 田志宏*
长江大学生命科学学院，荆州 434025
Techniques for Isolation of Protoplast from Cotyledon of Creeping Dichondra
(Dichondra repens Forst.)
YAN Han, TIAN Zhi-Hong*
College of Life Science, Yangtze University, Jingzhou 434025
提要 分离马蹄金无菌苗子叶的原生质体的结果表明，光下生长12 d的子叶置于含 2% 纤维素酶和0.8%果胶酶的酶解液中酶
解 9 h 后，游离原生质体的产率和活力分别为 2.75×106 个 ·g-1(FW)和 90%，酶解液中渗透剂——甘露醇的浓度以 0.5 mol·L-1 为
最适宜。
关键词 马蹄金；子叶；原生质体分离
收稿 2004-04-07 修定 2004-11-09
资助 湖北省重点科技发展计划项目(992P0603)和湖北省教
育厅重大项目(99Z007)。
* 通讯作者(E-mail: hntzh@263.net, Tel: 0716-8066858)。
马蹄金(Dichondra repens Forst.)为旋花科马蹄
金属的多年生蔓性常绿草本，是优良的地被兼观
赏植物[1]。马蹄金有性繁殖较难，不易结实，其
品种改良在一定程度上受到了制约，而生物技术
育种则为克服这一障碍开辟了一条可能的新途径。
我们实验室已经建立了马蹄金的组织培养植株再生
体系[2,3]，这是开展原生质体培养和融合及转基因
工作的基础。原生质体是研究细胞生理现象的理
想材料，也是遗传转化的理想受体[4]。有关马蹄
金原生质体的研究国内外未见报道。本文以马蹄
金无菌苗子叶为材料，对其原生质体的制备条件
进行了研究，旨在为马蹄金原生质体水平上的遗
传转化、突变体筛选以及体细胞融合育种提供必
要的技术途径。
材料与方法
马蹄金(Dichondra repens Forst.)种子系从美国
引进，由中国种子集团公司草业有限责任公司提
供。无菌苗培养参照前文[3]的方法稍作改进。取
适量的马蹄金种子，先用自来水洗净表面的包衣
剂，至露出褐色表皮，再用洗洁精清洗 1 次后于
流水中冲洗10 min，而后用70% 酒精消毒30 s，
再以0.1% HgCl2浸泡12 min，最后用无菌水冲洗
3次，接种于MS 培养基[5]中，分别置于黑暗处及
光照下萌芽和生长。培养温度为(26±1)℃，光照
14 h·d-1，光照度0.028 mmol·m-2·s-1。
原生质体游离参照前文[6,7]的方法并作一些修
改。取萌发不同时间(6、8、10、12、14、16
d)的马蹄金无菌苗子叶约1 g，将其用解剖刀切成
0.5~1 mm 宽的小条，置于盛有 CPW-13M(含 13%
甘露醇)溶液[8]的培养皿(直径7.5 cm)中，在室温
下质壁分离 0.5~1 h。然后换入 10 mL 酶解液，
放在(26±1)℃摇床上遮光轻轻摇动(50 r·min-1)酶
解。酶解液成分为：分别将一定含量的纤维素酶
(cellulase, Onozuka R-10)、半纤维素酶
(hemicellulase, Sigma)和果胶酶(pectinase, Fluka)溶
解在含有一定甘露醇浓度的 CPW 溶液中，并附加
0.5 g·L-1小牛血清白蛋白(BSA)和5 mmol·L-1 2-(N-
吗啡啉)乙磺酸(MES)。待酶完全溶解后，调节pH
值为5.7，然后通过直径0.45 mm的微孔滤膜过滤
灭 菌 。
在原生质体酶解过程中，每隔2 h 在倒置显
微镜下观察一次，以观察到原生质体的平均密度
较前1 h 不再增加为最适酶解时间。以最适酶解
时间时所观察的酶解液与游离原生质体混合液中原
生质体占原生质体、细胞团和单细胞总含量的百
分比来探讨较好的酶解条件。酶解充分后，用50 mm
(300目)孔径的尼龙网过滤酶解分离的原生质体，
将滤液收集到 10 mL 的尖底离心管中，以 500
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r·min-1 离心 5 min，弃上清液，再用 CPW-9M(含
9% 甘露醇)溶液洗涤 2 次，将留下的原生质体悬
浮于2 mL CPW-9M 溶液中，然后在另一只10 mL
的尖底刻度离心管中加入 8 mL CPW-21S(含 21%
蔗糖)，在此液面上缓缓加入上述的 2 mL 原生质
体悬浮液，再以 500 r·min-1 离心 5 min。这时，
在两个液面中间出现一条绿色原生质体带(图 1)，
用吸管小心地吸出漂浮于溶液界面间的原生质体。
最后，用原生质体培养液清洗 1 次，即可获得纯
化的马蹄金子叶原生质体(图 2)。
原生质体产量用 0.1 mm 血球计数板计数统
计，单位为：个(原生质体)·g-1(子叶)，原生质
体活力用0.1% Evans 蓝染色测定。
结果与讨论
1 子叶叶龄和光照条件对原生质体游离的影响
图 3 和 4 表明，从光下培养生长的马蹄金无
菌苗子叶游离的原生质体，无论是产量还是活力
都比黑暗下的高。在光照条件下生长的马蹄金子
叶游离原生质体的产量和活力的峰值出现在十二天
龄时，分别为1.45×106 个 ·g-1(FW)和 89%；超过
十二天龄的子叶，其游离的原生质体个体较大，
活力较差。而黑暗条件下生长的马蹄金子叶游离
原生质体的产量和活力的峰值则出现在十天龄时，
分别为0.52×106个 ·g-1(FW)和 64%。这可能与黑暗
条件下原生质膜发育不好和液泡化有关。因此，
马蹄金无菌苗子叶生长时的光照条件和发育时期是
获得高产量和高活力原生质体的一个重要因素。
图1 界面离心形成的原生质体带
图2 纯化的原生质体
图3 黑暗条件下不同叶龄子叶的
游离原生质体的产量和活性
酶解液含 2% 纤维素酶、0. 5 % 果胶酶和 CP W - 9 M，酶解
10 h 后观察结果。
图4 光照条件下不同叶龄子叶的
游离原生质体的产量和活性
酶解液含 2% 纤维素酶、0. 5 % 果胶酶和 CP W - 9 M，酶解
10 h 后观察结果。
2 不同酶的浓度组合对游离原生质体产量的影响
采用不同浓度的纤维素酶、果胶酶和半纤维
素酶组合酶解光照条件下萌芽生长的十二天龄的无
菌苗子叶，其游离原生质体的产量明显不同。从
表 1 可见，纤维素酶浓度以 2% 为宜，过高(3%)
或过低(1 % )对游离原生质体的产量均有不良影
响。果胶酶浓度则以 0.8% 较为合适。半纤维素
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酶对原生质体的游离是不必要的，当纤维素酶浓
度为 2%、果胶酶浓度为 0.8% 时，添加 0.5% 的
半纤维素酶反而使游离原生质体的产量降低，酶
解液中原生质体的碎片较多，可能是酶解液中酶
的浓度过高的原因。
3 不同酶解时间对原生质体游离的影响
用2% 纤维素酶和0.8% 果胶酶组合对光照条
件下萌芽生长的十二天龄的无菌苗子叶进行原生质
体游离。开始酶解后3、5、7、9和11 h，观察的
酶解效果明显不同。表2显示，当酶解时间为3 h
时，只有极少量的原生质体释放；随着酶解时间
的延长，原生质体的产量逐渐增高，酶解9 h时，
其产量达到最高；当酶解11 h 时，原生质体的产
量又逐渐下降，酶解液中碎片较多，说明原生质
体产量下降是最早游离的原生质体大量破碎所致。
表1 不同酶的浓度组合对原生质体产量的影响
酶解液编号 纤维素酶浓度 /% 果胶酶浓度 /% 半纤维素酶浓度 /% 产量/×106个 ·g-1(FW)
ES1 1 0.5 0.5 0.70
ES2 1 0.5 0 0.79
ES3 1 0.8 0.5 0.82
ES4 1 0.8 0 0.75
ES5 2 0.5 0.5 1.25
ES6 2 0.5 0 1.43
ES7 2 0.8 0.5 1.86
ES8 2 0.8 0 2.26
ES9 3 0.5 0.5 0.30
ES10 3 0.5 0 0.35
ES11 3 0.8 0.5 0.29
ES12 3 0.8 0 0.27
表中数据为(26±1)℃、黑暗条件下酶解 10 h 后观察的结果。
解，在不同浓度渗透压稳定剂——甘露醇的条件
下，游离原生质体产率明显不同(图 5 )。在
0.3~0.5 mol·L-1的甘露醇范围内，原生质的产率
明显上升，0.5 mol·L-1时达到最大[2.75×106个 ·g-1
(FW)]，活性为 90%。游离的原生质体形状、大
小基本一致，胞质浓，内含物丰富，叶绿体清
晰可见(图 2)。随着浓度的进一步升高，其产率
逐渐下降。故我们采用0.5 mol·L-1的甘露醇(CPW-
9M)作为渗透压稳定剂。
总之，原生质体分离极大程度地受到供体组
织、细胞壁降解酶及渗透压稳定剂等因素的影响[4]。
单子叶植物原生质体游离大多采用的是胚性悬浮细
胞，而双子叶植物中无菌苗的各个部分都是理想
的供体材料。茄科植物一般选用幼嫩的叶片分离
原生质体，十字花科植物选用下胚轴较好，而在
豆科植物中以未成熟胚的子叶游离的原生质体得率
表2 不同酶解时间对子叶原生质体游离效果的影响
酶解时间/h 原生质体产率/×106个·g-1(FW)
3 0.03
5 0.23
7 1.57
9 2.75
11 2.18
4 不同浓度渗透压稳定剂——甘露醇对游离原生
质体产率的影响
在原生质体游离过程中，将十二天龄的绿色
子叶用含 2% 纤维素酶和 0.8% 果胶酶的酶解液酶
图5 不同浓度甘露醇对子叶原生质体产量的影响
(26±1)℃、黑暗条件下酶解 9 h 后统计。
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高、活力强。本文仅选用了马蹄金无菌苗子叶游
离原生质体，以光照条件下萌发生长的十二天龄
的子叶效果为好，但并未与其它外植体作对比。
降解高等植物细胞壁一般由纤维素酶、果胶酶及
半纤维素酶中的一种或者多种配合使用。纤维素
酶Onozuka R-10具有较强的纤维素酶及一定的果
胶酶的活性，一般情况下与一定量的果胶酶配合
使用效果更佳。试验表明，马蹄金无菌苗子叶在
含 2% 纤维素酶和 0.8% 果胶酶的酶解液中进行酶
解 9 h 后，游离原生质体的产率和活性均较高，
且酶解液中渗透压稳定剂——甘露醇的浓度以0.5
mol·L-1 为宜。供体组织经过酶解后除得到大量的
完整原生质体外，酶解液中还会有一些未消化的
细胞团以及破碎的细胞，这将对原生质体培养产
生不良影响，因此可选择界面离心法纯化原生质
体，整个操作过程要细心，动作不要过大。由
于 CaCl2 是普遍使用的原生质膜稳定剂，MES 可
以刺激原生质体的释放，BSA 可以减少或防止降
解细胞壁过程中对细胞器的破坏，适量加入这些
原生质膜稳定剂后，可以分离到较高产率和高活
性的原生质体。
参考文献
1 韩烈保, 杨碚, 邓菊芬. 草坪草种及其品种. 北京: 中国林业
出版社, 1999. 175~176
2 田志宏, 严寒. 马蹄金的组织培养和植株再生. 植物生理学
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3 田志宏, 严寒, 李秋杰等. 马蹄金愈伤组织诱导及植株再生
研究. 华中农业大学学报, 2003, 22(4): 403~407
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5 Murashige T, Skoog F. A revised medium for rapid growth
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6 Tian Z, Meng J. Plant regeneration from cultured proto-
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究. 中国油料作物学报, 2002, 24(2): 10~13
8 Frearson EM, Power JB, Cocking EC. The isolation, culture
and regeneration of Petunia leaf protoplasts. Dev Biol,
1973, 33: 130~137
风范永存
——纪念《植物生理学通讯》公开发行后第一任主编倪晋山先生逝世二周年
陈因
中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所，上海 200032
毕生淡泊明志，博古通今，对事业勤勤恳恳，不浮不躁，探蹟索隐，取精用弘，处处以完美
为度，可谓儒林典范。
一世安贫乐道，殚见洽闻，做学问兢兢业业，慎独慎行，穹源竟委，务实求真，事事唯严谨
是从，堪称学界楷模。
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