全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月 777
液泡膜H+-PPase与植物耐盐性
包爱科 张金林 郭正刚 王锁民*
兰州大学草地农业科技学院农业部草地农业生态系统学重点开放实验室，兰州730000
Tonoplast H+-pyrophosphatase Involved in Plant Salt Tolerance
BAO Ai-Ke, ZHANG Jin-Lin, GUO Zheng-Gang, WANG Suo-Min*
Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystem, Ministry of Agriculture, College of Pastoral Agricultural Science and Technology,
Lanzhou University, Lanzhou 730000, China
提要 文章介绍植物液泡膜 H+-PPase 的结构、功能及其分子生物学的研究进展，并着重阐述液泡膜 H+-PPase 在植物耐盐
性中的作用。
关键词 液泡膜 H+-PPase；耐盐性；进展
收稿 2006-02-14 修定　 2006-05-29
资助　 国家自然科学基金(30270947)、新世纪优秀人才支持
计划(NCET-05-0882)、甘肃省农业生物技术研究与应
用开发项目(GNSW-2004-07)、农业部草地农业生态
系统学重点开放实验室 2004 年开放课题基金。
*通讯作者(E-mail: smwang@lzu.edu.cn, Tel: 0931-
8910983, Fax: 0931-8910979)。
液泡是细胞内的一个由单层膜包裹的细胞
器，它起源于内质网或高尔基体的小泡。在一个
成熟的植物细胞中，液泡占据40%~90% 的胞内空
间(Britten等1992)，它与细胞质一起维持细胞的
膨压，因而植物能够正常地生长和保持挺立的状
态(Gaxiola等2001)。在植物细胞中，液泡不是一
个静止的或被动的区域，而是具有多种功能，有
明显代谢活性的细胞器。除了维持细胞的渗透压
和贮存代谢的中间产物外，液泡内还含有多种水
解酶，其 pH 值偏酸且具有类似溶酶体的功能。
液泡膜 H+ 转运无机焦磷酸酶(H+-pyropho-
sphatase，H+-PPase，EC3.6.1.1)是一种区别于H+-
ATPase 的 H+ 转运酶，广泛存在于植物和少数藻
类、原生动物、细菌以及原始细菌中(Maeshima
2000)。在液泡膜上，H+-PPase 能够把无机焦磷
酸(PPi)水解产生的自由能和H+ 跨膜转运相耦联，
在将PPi水解为 2个 Pi的同时，还将细胞质中的
H+ 经液泡膜进入液泡内，起质子泵的作用，与液
泡膜 H+-ATPase 一起形成 H+ 跨液泡膜电化学梯
度，为各种溶质(如阳离子、阴离子、氨基酸和
糖类等)分子跨液泡膜的次级主动运输提供驱动力
(Blumwald 1987；王延枝 1990)。自 1975 年
Karlsson从甜菜(Beta vulgaris)根中分离到钾激活的
H+-PPase 以来，近几十年，此酶的研究已经取得
了长足的进展，并对其生理生化性质逐步达成共
识(赵利辉和刘友良1999)。随着分子生物学研究
的不断深入，人们已经成功地从包括陆生植物在
内的众多生物体中分离到 H+-PPase 的 cDNA，但
大多研究仍然集中在此酶的生化特性及其在亚细胞
结构中的定位和在组织中的分配上(Lü 等 2005)。
直到最近几年，一些学者才开始对此酶在植物抵
御盐胁迫中的作用进行了初步研究，本文就这方
面的研究进展介绍如下。
1 液泡膜H+-PPase的分子结构与功能
1.1 H+-PPase的分子结构
1.1.1 H+-PPase的分子克隆 1992年，Sarafian等
用 lZAP 作为表达载体构建拟南芥的 cDNA 文库，
第1次筛选克隆出完整的H+-PPase cDNA序列，命
名为AVP1 (M81892)。此后，人们相继从其它一
些陆生植物中克隆出H+-PPase的cDNA (表1)。除
陆生植物外，其它生物体中也克隆到H+-PPase的
基因，如光合细菌(Rhodospirillum rubrum，
AF044912，Baltscheffsky 等 1998)，原始细菌
(Pyrobaculum aerophilum，AF182812，
Dr o z d o w i c z 等 19 9 9 )，藻类如轮藻(Ch a r a
corallina，AB018529，Nakanishi等1999)和伞藻
(Acetabularia acetabulum，D88820，Ikeda等
1999)，原生动物如锥虫(Trypanosomacruzi，
AF159881，Scott等 1998)、疟原虫(Plasmodium
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falciparum，AF115766，Mcintosh等 2001)和弓
形虫(Toxoplasma gondii，Drozdowicz等2003)。
大量研究表明，大多数陆生植物 H+-PPase
cDNA 含有 2 283~2 319 个核苷酸的开放阅读框架
( O R F ) ，编码大约 7 6 1 ~ 7 7 3 个氨基酸残基
(Maeshima 2001；Lü 等2005)，计算出的分子量
为 80~81 kDa，但 SDS-PAGE 凝胶电泳检测得到
的分子量多为70~73 kDa (Rea和Poole 1993)，这
可能因为 H+-PPase 蛋白是一个疏水性的膜蛋白，
在SDS凝胶上迁移距离过远所致(Branden和Tooze
1991；Sarafian等 1992)。在 cDNA序列的同源性
方面，1998年，Nakanishi和 Maeshima总结了11
种不同陆生植物物种的H+-PPase氨基酸序列分析
结果，发现它们的同源性高达 86%~ 9 1 %。相比
之下，藻类和陆生植物H+-PPase氨基酸序列的同
源性则较低，例如绿藻为 7 1 % ，海藻更低，仅
为 4 7 % 。因此，从进化论的角度来看，绿藻与
陆生植物具有更近的亲缘关系(Maeshima 2001)。
在克隆H+-PPase cDNA 的过程中，许多研究
者还发现，有些陆生植物的H+-PPase拥有数个同
功酶(isoform)，并且在很多植物中也克隆出了编
码H+-PPase 的同源基因(homologous gene)，例
如，编码水稻 H+-PPase 的同源基因至少有 5 个
(OVP1~5，Brini 等 2005)，大麦中也已发现有 2
个(HVP1~2，Tanaka 等 1993)，甜菜中至少有 2
个(BVP1~2，Kim 等 1994)。研究发现，这些同
源基因的阅读区高度保守，但其非转录区的保守
性却很低(Maeshima 2000)。所以，H+-PPase可能
是一个多基因家族。
1.1.2 液泡膜H+-PPase的拓扑结构及其特性 在前
人大量研究的基础上，Maeshima (2000)以绿豆液
泡膜H+-PPase为基础，提出一个假定的植物液泡
膜H+-PPase 的拓扑结构模型(图 1)。在这个模型
中，液泡膜 H +- P P a s e 可能有 1 4 个跨膜区域
(1~1 4 )，其中包括 3 个保守片段(CS1、CS2、
CS3)，底物结合位点可能是突出于细胞质中的 e
环。保守区 CS1 中的一些酸性残基可能在 PPi 水
解和 H + 转运过程中起关键作用。免疫分析发现，
CS1 内有一段暴露于细胞质中的氨基酸残基序列
(DVGADLVGKVE)，可能是此酶的催化位点。初
步研究绿豆H+-PPase C末端保守区CS3的结果表
明，其中 3 个谷氨酸残基在酵母中表达，任何一
个被替换都会导致酶活性的丧失，这表明 CS3 可
能暴露在细胞质中，与 CS1 和 CS2 一起在酶的催
化功能中起关键作用。N -乙基顺丁烯二酰亚胺
(NEM)底物保护性结合位点是Cys-630 (拟南芥中
为Cys-634)半胱氨酸残基，呈环形，该位点在已
知的所有植物(也包括一些海藻、绿藻和原核生
物) H+-PPase序列中都是保守的(Maeshima 2000)。
Mg2+ 是液泡膜H+-PPase的一个必需的辅助因
表1 已克隆的一些陆生植物液泡膜H+-PPase cDNA序列
植物种类 氨基酸残基数 基因名称 基因库号码 参考文献
拟南芥(Arabidopsis thaliana) 770 AVP1 (AVP3) M81 892 Sarafian等1992
800 AVP2 AF182813 Drozdowicz 等 2000
大麦(Hordeum vulgare) 771 H V P 1 AB032839 Tanaka 等 1993
762 H V P 2 D13472
甜菜(Beta vulgaris) 765 BVP1 L32791 Kim 等 1994
761 BVP2 L32792
烟草(Nicotiana tabacum) 764 NtVP5 X77915 Lerchl等1995b
765 NtVP9 X83729
766 NtVP31 X83730
水稻(Oryza sativa) 772 O V P 1 D45383 Sakakibara等1996
768 O V P 2 D45384
绿豆(Vigna radiata) 766 VVP2 AB009077 Nakanishi和 Maeshima 1998
南瓜(Cucurbita moschata) 768 C m V P 1 D86306 Maruyama 等 1998
小麦(Triticum aestivum) 763 TVP1 AY296911 Brini等2005
野大麦(Hordeum brevisubulatum) 773 HbVP1 AY255181 Lü 等 2005
盐地碱蓬(Suaeda salsa) 764 SsVP — Guo 等 2006
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子，M g 2 + 对该酶不仅有激活作用，还有保护作
用，使其在较高温度下不易失活( M a e s h i m a
2000)。除受 Mg2+ 激活外，H+-PPase 还可能受 K+
和 NH4+ 等激活(Siswanto 等 1994)，在有些植物
中，H+-PPase活性尤其是H+ 转运活性表现出对K+
的绝对需要(Pugliarella等1991)。有趣的是，2000
年，Drozdowicz等发现了拟南芥的另外一种液泡
膜 H+-PPase——AVP2，AVP2 和 AVP1 一样，也
可以为 Mg2+ 激活，但与 AVP1 不同的是，它对 K+
等一价阳离子并不敏感，却对 C a 2+ 敏感；比较
AVP2 与 AVP1 的氨基酸序列，发现它们的同源性
只有 3 6 %。因此，D r o z d o w i c z 等( 2 0 0 0 )、
Belogurov和Lahti (2002)认为，同一个有机体中的
H+-PPase可以分为2个类型，即Ⅰ型(AVP1类)和
Ⅱ型(AVP2类) 。他们分析拟南芥和其它有机体中
的H+-PPase系统发生的结果进一步表明，Ⅱ型H+-
PPase 并不是Ⅰ型H+-PPase 的同功酶，而是存在
于植物(甚至一些真核生物和原核生物)体内的另外
一类 H+-PPase；在同一个有机体内，Ⅰ型和Ⅱ型
H+-PPase 共存于液泡膜上，但可能定位于液泡膜
的不同区域，调节细胞的不同生理过程。
1.2 H+-PPase的主要功能
1.2.1 质子泵功能 H+-PPase作为质子泵，和H+-
ATPase 一起将细胞质中的 H+ 泵入液泡中，一方
面，建立跨液泡膜电化学梯度，为无机离子及其
他溶质进出液泡提供驱动力(Blumwald 1987)，既
能维持细胞离子平衡和渗透平衡，又能减轻一些
无机离子(比如 Na+ 和 Cl-)对细胞质的毒害；另一
方面，可以使液泡酸化和细胞质碱化，有利于细
胞质中生理生化反应的顺利进行。
1.2.2 参与K+向液泡内的主动运输 H+-PPase是否
参与K+ 向液泡内的主动运输，目前还存在很多争
议。Davies等(1992)和Obermeyer等(1996)用膜片
钳技术分别检测甜菜和东亚市藜(Chenopodium
rubrum)液泡 H+-PPase 的结果显示，液泡膜 H+-
PPase可能是作为H+/K+共向转运蛋白，介导K+向
液泡内的运输，其耦联比为1.3 H+/1.7 K+/1 PPi。
但另外一些学者却并不认同这个看法，他们认
为，H+-PPase 蛋白重组和42K+ 示踪实验没有证实
K+的这一运输过程(Sato等1994)，Ros等(1995)用
荧光探针法也没有检测到H+-PPase对K+的主动运
输过程。
1.2.3 参与蔗糖的生物合成 植物体内的蔗糖合成
酶和尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose,
UDPG)焦磷酸化酶将蔗糖转化为葡萄糖和己糖磷酸
盐。这一过程中形成的PPi主要由液泡膜H+-PPase
清除(Lerchl等1995a)。
1.2.4 控制植物生长素的运输 Li等(2005)报道，
拟南芥 AVP1 除了酸化液泡外，还控制植物生长
素的运输，从而影响着依赖生长素的各种发育过
程。他们发现，AVP1 的过量表达导致植物器官
形成时的细胞分裂、增生加快以及生长素运输增
快；相反，avp1-1突变体的根和地上部分发育都
受到削弱，生长素运输也变得缓慢。其原因是
AVP1表达的变化会影响与生长素分布有关的2种
蛋白(三磷酸腺苷酶和生长素外流介体PIN1)的分
布和数量。因此，AVP1 作用的结果是生长素外
流变得更为容易，从而促进根系发育和植株地上
部分的生长。
2 液泡膜H+-PPase与植物耐盐性的关系
2.1 盐胁迫下的植物液泡膜H+-PPase活性 各种逆
境条件(如低温、缺氧和盐分胁迫等)都能影响植
物中 H+-PPase 的活性(赵利辉和刘友良 1999；
Maeshima 2000)。从目前的资料看，有关盐胁迫
对H+-PPase 影响的看法主要有二：(1) Na+ 对 H+-
PPase 有抑制作用，NaCl 胁迫下，植物H+-PPase
活性降低。Matsumoto 和 Chung (1988)用 200
mmol·L-1 NaCl处理大麦根3 d后发现，其H+-PPase
活性只有未做 NaCl 处理的一半；Nakamura 等
(1992)将绿豆根置于100 mmol·L-1 NaCl中，绿豆
H+-PPase 活性强烈受抑；Bremberger 和 Lüttge
(1992)用 400 mmol·L-1 NaCl 处理的冰叶日中花
(Mesembryanthemum crystallinum)后，盐处理植株
中的 H+-PPase 活性在各个生长阶段都低于未做
图1 H+-PPase的多肽结构模式(Maeshima 2000)
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NaCl处理的植株。(2) NaCl诱导 H+-PPase活性或
转录水平增加。用50 mmol·L-1 NaCl处理 10 d的
胡萝卜(Daucus carota)中，H+-PPase活性是未做
NaCl 处理的 2 倍(Colombo 和 Cerana 1993) ；
Zingarelli等(1994)用80 mmol·L-1 NaCl处理欧亚槭
(Acer pseudoplatanus)后，其H+-PPase活性也成倍
增加；Fukuda等(2004)用100 mmol·L-1 NaCl处理
大麦后，其根中H+-PPase转录水平显著升高，Lü
等(2005)用200 mmol·L-1 NaCl处理野大麦后也得
到了相同的结果；Vera-Estrella等(2005)用200
mmol·L-1 NaCl处理盐芥(Thellungiella halophila)后，
盐芥叶片中H+-PPase水解活性是未做NaCl处理的
1.3倍；Guo等(2006)将盐地碱蓬(Suaeda salsa) H+-
PPase基因 SsVP转入拟南芥，400 mmol·L-1 NaCl
处理能够诱导转化植株叶中 SsVP 的表达。但是，
Brini等(2005)观察到，生长在200 mmol·L-1 NaCl
胁迫下的小麦根和叶中，H+-PPase 转录水平与未
做NaCl处理的均无明显差异。以上结果表明，盐
胁迫下，植物液泡膜H+-PPase活性或转录水平的
变化可能与植物种类、器官类型、发育状态以及
盐溶液中的 Na+ 浓度有关。
有趣的是，赵利辉和刘友良(1999)发现，在
100和 200 mmol·L-1 NaCl 处理下，耐盐的大麦品
种‘鉴4’根系和叶中H+-PPase水解活性均上升，
而不耐盐的‘科品7号’根系和叶中H+-PPase 水
解活性均下降。Yu等(2005)的研究也发现了类似
的现象，他们将大豆(Glycine max)栽培品种
‘Wenfeng7’和‘Union’在 0.3% (W/V) NaCl
下处理 3 d，发现耐盐品种‘Wenfeng7’根中 H+-
PPase 活性升高，而在盐敏感品种‘Union’的
根中却没有观察到类似的结果。所以，H+-PPase
似乎也可以作为衡量植物耐盐性的一个指标。
2.2 液泡膜H+-PPase在植物抵御盐及干旱胁迫中
的作用 在盐胁迫下，植物细胞要维持离子平衡，
就要吸收大量的无机离子，但高浓度的无机离子
(特别是Na+和Cl-)会不可避免地对细胞中的代谢系
统造成伤害(Rodriguez 等 1997)。所以，在高盐
环境中，盐生植物细胞常常将过多的Na+和 Cl-区
隔在液泡中，这既可以克服由于盐分过高造成的
生理干旱，又可以减轻这 2 种离子对细胞质产生
的毒害作用(Blumwald 和 Poole 1985；Niu 等
1995)。有研究证明，盐生植物和甜土植物在对
盐胁迫的适应过程中都有离子区隔化，但盐生植
物的离子区隔化更为明显和有效(Blumwald 2000)。
当Na+和 Cl-被区隔在液泡内时，盐生植物为了维
持细胞内的渗透平衡，在它们的细胞质和其它细
胞器中就会积累大量的 K + 和有机渗透调节物质
(Rhodes和 Hanson 1993)。
众所周知，离子的吸收和运输主要靠主动运
输完成。各种膜转运蛋白，特别是质膜和液泡膜
转运蛋白在离子主动运输过程中起作用。高盐条
件下，盐生植物主要依靠液泡膜Na+/H+ 逆向转运
蛋白将细胞质中过多的 N a + 区隔到液泡中
(Blumwald和Poole 1985；Staal等1991)。迄今为
止，已经有很多植物的液泡膜Na+/H+ 逆向转运蛋
白基因得到克隆( 任仲海等 2 0 0 2 ；吕慧颖等
2003)。众多的研究表明，过量表达液泡膜 Na+/
H+ 逆向转运蛋白基因可增强植物的抗盐性(Xue等
2004；Yin 等 2004；Lü 等 2005)。
在离子区隔化过程中，液泡膜Na+/H+ 逆向转
运蛋白必须依靠液泡膜质子泵(H+-ATPase 和 H+-
PPase)形成的 H+ 跨膜电化学梯度，为其提供驱动
力(Blumwald 1987；Blumwald和Gelli 1997)。这
意味着通过增大液泡膜质子泵基因表达来增大 H+
跨膜梯度，可以为液泡膜Na+/H+ 逆向转运蛋白介
导Na+/H+ 交换提供更强大的驱动力，这样就有可
能将细胞质中过多的 Na + 区隔化到液泡内腔中，
增强细胞的耐盐性。
Wang等(2001)的研究表明，在对盐地碱蓬耐
盐性的贡献上，液泡膜 H+-ATPase 的作用要大于
H+-PPase的作用。但另外一些研究者却认为， 液
泡膜H+-PPase建立H+跨膜电化学梯度是与液泡膜
H+- A T P a s e 的作用相当的，甚至有更大的效应
(Britten 等 1992)。因此，从理论上说，液泡膜
上2个 H+ 泵中的任何一个过量表达，都有可能提
高 H+ 的利用率，增大 H+ 跨膜梯度(Gaxiola 等
2001)。但是，液泡膜 H+-ATPase 过量表达并不
是一件容易的事，因为此酶是由许多亚基组成，
只有当编码这些亚基的基因同时达到超表达的水平
时，液泡膜H+-ATPase才能实现超表达(Gaxiola等
2001)，这样的基因在拟南芥中至少有26个(Sze等
2002)，就目前的技术水平而言，要做到这一点，
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显然是相当困难的。相比之下，液泡膜H+-PPase
结构非常简单，它只由一条受单基因编码的多肽
组成(Maeshima 2000)，因此，H+-PPase超表达就
相对简单些(Gaxiola等2001)。
1999年，Gaxiola等将拟南芥液泡膜H+-PPase
基因 AVP1在酵母盐敏感突变体ena1上超表达后，
得到了2个很有说服力的实验结果：(1)该突变体
恢复了耐盐性；(2)在前液泡(prevacuolar)膜上必须
要有能够介导耐盐性的功能性离子载体(Nhx1 和
Gef1)。2005 年，Brini 等克隆了小麦液泡膜H+-
PPase基因 TVP1，并将其在ena1突变体上异源表
达，得到了与Gaxiola等(1999)相一致的结果。这
2个实验直接证明了H+-PPase活性与细胞耐盐性有
关。后来，Gaxiola等(2001)又将带有35S启动子
的 AVP1 基因转入拟南芥，与同基因型的野生型
相比，AVP1 超表达的转基因植株耐盐性和耐旱
性显著提高，能在 250 mmol·L-1 NaCl 中正常生
长；他们进一步研究的结果表明，在转基因植株
液泡中，包括 N a + 在内的阳离子的积累明显增
加。P a r k 等( 2 0 0 5 ) 将 A V P 1 基因转入番茄
(Lycopersicon esculentum)的一个商业栽培品种
(money maker)中，转基因植株表现出下列特点：
根系生长较为强壮，生物量显著增加；根系液泡
中积累大量依赖于 H+-PPase 驱动而运输的阳离
子，因而转基因植株耐旱性明显增强。另外，
Guo (2006)等将盐地碱蓬H+-PPase基因SsVP转入
拟南芥，发现超表达SsVP的转基因拟南芥的耐盐
性和耐旱性显著提高。这些结果表明：在盐分或
水分胁迫下，H+-PPase超表达能够增强H+ 跨液泡
膜电化学梯度，提高液泡膜上有H+ 参与的各种次
级运输载体(包括液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白)的运
输效率，促进包括 Na+ 在内的各种离子向液泡内
的运输和积累，从而维持了细胞中离子的平衡和
细胞的膨压，同时也可减轻过多 Na+ 对细胞造成
的伤害，进而增强细胞的耐旱性和耐盐性。可
见，H+-PPase 作为一种有效的质子泵，在植物对
水分胁迫和盐分胁迫的响应中，可能扮演着重要
的角色。
3 结语
液泡膜H+-PPase是一种广泛存在于很多生物
体内的 H+ 转运酶。它只包含一条分子量约为 80
kDa 的多肽，结构简单；其底物为简单的低价焦
磷酸(PPi)，含有一个高能磷酸酐键。在植物细胞
中，H+-PPase 除了作为一种有效的质子泵调节细
胞的酸度，驱动各种离子在液泡内的区隔化外，
还可作为一种调节因子控制植物生长素的运输，
在植物响应逆境胁迫和调节植物生长发育的过程中
可能起作用。
至于今后这一领域的研究，有两个方面可以
考虑：(1)利用分子生物学手段，对植物液泡膜
H+-PPase 的功能和作用机制深入研究，特别是揭
示其水解PPi 和转运 H+ 的耦联机制，将成为重要
的研究方向；(2)将H+-PPase基因与其它耐盐抗旱
基因一起转入甜土植物中并超表达，从而获得一
批耐盐性和抗旱性较强的转基因植物新品种，这
对改良和利用大面积盐荒地，发展干旱、半干旱
地区的农业是重要的。
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