全 文 ：植物生理学通讯 第 41卷 第 1期，2005年 2月 37
影响椪柑上胚轴再生不定芽的几个生理因素
黄家权 邬志荣 孙中海*
华中农业大学柑橘研究所，武汉 430070
提要 探讨几种因素对 柑实生苗上胚轴再生不定芽影响的结果表明，在 6-BA 1 mg·L-1 和 NAA 0.1 mg·L-1 下， 柑上胚轴
切段的出芽率达到 61.1%，每个上胚轴上的不定芽数也同时达到最大(7.10 个); 黑暗处理 20 d 后转入光照条件下培养可提
高 柑上胚轴切段不定芽的再生率；上胚轴水平放置于培养基中有利于不定芽的再生，形态学下端插入培养基有利于不
定芽的生长。再生的不定芽在附加 NAA 0.1~1 mg·L-1 的 1/2MT 培养基中生根并再生 柑植株。
关键词 柑；不定芽；上胚轴；再生
Several Physiological Factors Influencing Adventitious Bud Regeneration from
the Epicotyls of Ponkan (Citrus reticulata Blanco)
HUANG Jia-Quan, WU Zhi-Rong, SUN Zhong-Hai*
Citrus Research Institute, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070
Abstract Several physiological factors influencing the bud regeneration from the epicotyls of Ponkan (Citrus
reticulata Blanco) were studied. The results showed that epicotyl segments horizontally placed in the medium
and 20-d dark incubation followed by the continuous light condition enhanced the bud regeneration from the
Ponkan epicotyl segments. However, the best growth quality of the adventitious buds was obtained when
epicotyl segments inserted in the medium with the morphological lower end. The highest rate of adventitious
bud regeneration was reached when the MT medium supplied with 6-BA 1 mg·L-1 and NAA 0.1 mg·L-1. The
plantlet formed when the buds were subcultured in 1/2MT with 0.1-1 mg·L-1 NAA.
Key words Citrus reticulata Blanco; adventitious bud; epicotyls; regeneration
收稿 2004-05-11 修定 2004-11-01
资助 农业部“948”柑桔项目(99 2 0 1 9 )。
* 通讯作者(E-mail: sunzhonghai@mail.hzau.edu.cn, Tel:
027-87281587)。
柑橘杂交育种进展缓慢的主要原因是多胚
性、童期长和遗传上的高度杂合。传统育种方法
难以适应生产的需要。体细胞原生质体融合的研
究，虽然实现了柑橘基因组的转移，得到了一大
批种间及属间体细胞的杂种[1]，但由于一些不良
性状的连锁，无法实现某个或某些基因的定向转
移。随着遗传转化技术的发展，虽然已实现了在
基因水平上定向地通过基因转移来改良柑橘的农艺
性状，但仍然没有建立一个高效的植株再生体
系。在现有柑橘遗传转化的报道中，植株再生体
系主要采用原生质体再生[2,3]、体细胞胚发生[4,5]和
实生苗茎段的器官发生[6,7] 3种途径。采用原生质
体作遗传转化受体，可以避免转化嵌合体的出
现，但其转化频率低，有时难以获得转基因植
株；体细胞胚再生途径，再生频率较高，但经
过分化和脱分化后变异频率较高。而通过实生苗
茎段器官发生，较前两种途径具有操作简单，培
养物变异小等优势。
柑橘类实生苗的上下胚轴[6~9]、茎段[10]、叶
片[11]等离体培养再生植株的研究已有许多报道。
但用器官发生途径再生植株时，基因型对其影响
很大。Bordon 等[9]比较光照、激素和外植体接种
方式对 4 个柑橘品种上胚轴切段离体再生的影响
时，发现不同品种的器官再生情况有质和量上的
差别。这一结果进一步说明，一个高效的植株再
生体系工作应针对不同柑橘品种进行优化。
椪柑具有生长快、成形迅速、结果早的生物
学特性，是优质高产的柑橘良种，在南方各省已
普遍推广。但是，椪柑还具有种子多、不抗寒
等不良特性。如何在不改变其现有优良品质的条
件下定向改造椪柑品种，是当前亟待解决的问
植物生理学通讯 第 41卷 第 1期，2005年 2月38
题。椪柑种子萌发成的植株绝大多数都从珠心胚
发育而来，因此具有和母本相同的遗传特性。现
有的椪柑遗传转化离体再生体系的研究只有珠心组
织的报道。采用上胚轴作为外植体通过器官直接
发生途径再生不定芽，能够继续保持其优良特
性，并能利用转基因定向改造椪柑。本文在前人
工作的基础上，对影响椪柑上胚轴离体再生植株
的几个生理因子作了研究，得到一个较为适宜的
椪柑上胚轴再生体系，现报道如下。
材料与方法
椪柑(Citrus reticulata Blanco)种子在超净工作
台上用75% 的酒精处理30 s，0.1% 升汞溶液(加
2滴吐温-20)中浸泡 10 min 后用无菌水清洗3~4
次，剥去种皮，播种在培养基：MT[12]+40 g·L-1
蔗糖+7 g·L-1琼脂(pH 5.8~6.0)中，光照条件下(16/
8 h，光/暗周期)培养1个月，光照度约为75 mmol·
m-2·s-1，培养温度为(25±2)℃。
不定芽(梢)诱导培养基以MT 为基本培养基，
附加各种生长调节剂(在高压灭菌前加入)和蔗糖，
用7 g·L-1琼脂使培养基固体化，培养基pH用0.1
mol·L-1 的 NaOH 调至 5.8~6.0，高压灭菌条件为
121℃下保持20 min。
诱导不定芽(梢)中的生长调节剂选用6-BA和
NAA，6-BA 分 0.1、0.5、1.0、2.0 mg·L-1 4 个
水平；NAA 分 0.01、0.05、0.1、0.5 mg·L-1 4
个水平。6-BA 和 NAA 共 16 个组合，每个处理至
少用 20 个外植体。
取实生苗上胚轴，横切成 1.0 cm 左右的切
段，按上胚轴上部、上胚轴下部、上胚轴中部
3个种类平放于不定芽(梢)诱导培养基上，分别置
于光培养和连续暗培养20 d再转入光下。50 d后
观察记录上胚轴不定芽(梢)的发生情况。从实验
中选择最佳植物生长调节剂的组合，然后进行上
胚轴放置方式和光照条件比较实验。
取最佳生长调节剂组合的培养基，以椪柑上
胚轴为外植体，采用3种接种方式：(1)上胚轴水
平放置， (2)形态学下端垂直插入， (3)形态学上
端朝下垂直插入，再置于不同的光照处理条件下
培 养。
再生梢生根时，切下大于 8 mm 的不定梢转
移到生根培养基中。生根培养基为：1/2MT 基本
培养基附加25 g·L-1蔗糖、7 g·L-1琼脂以及不同浓
度水平的NAA(0.1、0.5、1.0、4.0 mg·L-1)，光
照条件下培养。
数据分析采用变量分析法。出现明显差异
时，则采用邓肯氏(Duncan)新复极差测验进行多
重比较，检测以 5 % 的水平为差异显著。
结果与讨论
1 不同部位上胚轴不定芽(梢)发生能力比较
近叶端的上胚轴(上部)出芽率高，但不定芽
数低；而近子叶端(下部)的出芽率低，但不定芽
数较高(表1)。这与贺红等[13]研究红江橙的结果不
同。我们认为，可能是本文采用的植物生长调节
剂是 6-BA 和 NAA 组合，而贺红等的实验中只附
加了 6-BA，因而影响了不同部位上胚轴的出芽
率。这同时也说明，在不同部位上胚轴的内源激
素分布是有差异的。
2 NAA和6-BA的不同组合对上胚轴不定芽(梢)发
生的影响
在 MT 基本培养基中，椪柑上胚轴以形态学
下端插入培养基时能再生不定芽，但再生频率
低；水平放置于培养基中的上胚轴无不定芽的生
成。MT 基本培养基附加一定浓度的 6-BA 有利于
不定芽(梢)的发生。上胚轴接种后 1 周左右，两
端开始膨胀，有的形成愈伤组织，以暗培养条件
下的较多，颜色偏白色；接种后第 3 周开始形成
芽。6-BA 为 1.0 mg·L-1 时，出芽率达到61.11%，
此时不定芽数也达到最大5.14个。随着6-BA浓度
的降低或升高，出芽率及不定芽数都随之下降。
6-BA为 2.0 mg·L-1 时，只有极少数上胚轴产生不
定芽(表 2)，多数膨胀或黄化，愈伤极少；不定
表1 不同部位上胚轴成芽能力的比较
Table 1 Comparision of adventitious bud regeneration from
different parts of Ponkan epicotyls
上胚轴切段部位 出芽率/% 每个上胚轴的不定芽数/个
上部 45.83 2.55
下部 26.04 3.64
中间 28.13 2.04
植物生理学通讯 第 41卷 第 1期，2005年 2月 39
和上胚轴上的不定芽数为最高，是16个组合中的
最佳组合。在这种条件下，椪柑上胚轴产生 7.4
个生长良好的不定芽(梢)，不定芽发生率也达到
61.1%，与前人的结果[14]相似。
3 培养基中上胚轴放置方式对不定芽(梢)发生的影响
以3 种方式将上胚轴切段放置于加有最佳生
长调节剂的 MT 培养基中的结果显示，水平放置
的上胚轴两端都发生膨大，形成不定芽；形态学
下端插入培养基的上胚轴基部膨大，形成愈伤组
织，端部无明显膨大，形成不定芽；在光照培
养条件下，形态学上端插入的上胚轴基部发生的
愈伤组织少，少数端部膨大，没有愈伤组织和不
定芽形成。在黑暗中培养 20 d 后转入光时，上
胚轴基部膨大形成白色愈伤组织，端部裂开，有
的形成少量愈伤组织，有少数发生不定芽。在连
续光照或黑暗20 d后转入光照培养的条件下，水
平放置时再生的不定芽数高于其他两种放置方式。
但形态学下端插入的上胚轴出芽很快，1 周左右
就明显有不定芽的形成；而水平放置的 2 周后才
有不定芽形成。形态学下端插入的上胚轴形成的
不定芽质量高，不定梢生长快。形态学上端插入
培养基的上胚轴无论是出芽的速度还是出芽率都明
显低于其他两种放置方式(图1)。这可能与生长素
的极性运输有关。芽的生长质量与上胚轴质量也
有一定的关系，生长好的上胚轴发生的不定芽质
量也好，这可能与生长好的上胚轴自身对培养基
营养的利用能力较强有关。根据前人一般上胚轴
出芽率最高，茎段次之，子叶和叶片较低[15]的实
图1 上胚轴切段在培养基中放置方式以及
光照对芽形成的影响
Fig.1 Effects of epicotyl segment orientation and light
condition on adventitious buds formation
芽较短或较弱小，黄化死亡的比率增加。说明高
浓度6-BA不仅抑制芽的形成，而且对上胚轴有毒
害作用。
NAA 加入到含 6-BA 的培养基中后，可提高
不定芽(梢)数量，但是效果不十分明显(表2)。仅
当 6-BA为 1.0 mg·L-1 时，附加不同浓度的NAA的
不定芽数才有显著性差异；而在其他浓度 6-BA
中，在 0~0.1 mg·L-1 NAA 范围内，各处理之间
的不定芽数无显著差异。高浓度NAA(0.5 mg·L-1)
下，不定芽发生率降低；而低浓度下的不定芽发
生率主要由 6-BA 浓度决定，如 6-BA 浓度为 0.1
mg·L-1，NAA 浓度小于 0.01 mg·L-1 时，不定芽的
发生率均超过50%，而当 6-BA 浓度为 2.0 mg·L-1
时，不定芽发生率均小于 20%。所有组合中，以
6-BA为 1.0 mg·L-1 和 NAA为 0.1 mg·L-1 的发芽率
表2 6-BA和 NAA不同浓度组合对椪柑
上胚轴不定芽发生的影响
Table 2 Effects of combinations of various concentrations of
6-BA and NAA on adventitious buds proliferation
in epicotyls pieces of Ponkan
植物生长调节物质的浓度/mg·L-1 上胚轴平均 不定芽发 不定芽数/个1)
生率/% 6-BA NAA
0.1 0 1.63cdf 52.8
0.1 0.01 1.42cdf 55.6
0.1 0.05 1.66cdf 44.4
0.1 0.10 2.00bcd 33.3
0.1 0.50 2.25cdf 22.2
0.5 0 2.19cdf 44.4
0.5 0.01 4.00bcd 33.3
0.5 0.05 2.60bcd 27.8
0.5 0.10 1.70cdf 61.1
0.5 0.50 1.63cdf 38.9
1.0 0 5.14bc 61.1
1.0 0.01 5.64ab 55.6
1.0 0.05 4.71bc 44.4
1.0 0.10 7.40a 61.1
1.0 0.50 2.29bcd 11.1
2.0 0 4.20bcd 13.9
2.0 0.01 1.19cdf 16.7
2.0 0.05 0.14df 5.6
2.0 0.10 0.14df 5.6
2.0 0.50 0.64cdf 16.7
1)邓肯的新复极差法的多重比较，相同字母表示差异不显
著 。
植物生理学通讯 第 41卷 第 1期，2005年 2月40
验结果，我们只选取上胚轴为外植体。
4 光照条件对上胚轴不定芽(梢)发生的影响
由图1 可以看到，各种放置方式的上胚轴在
黑暗下培养 20 d 后的不定芽个数远远高于光照
的。这说明适当的暗中培养可增加上胚轴的脱分
化和再分化能力，提高上胚轴再生不定芽的水
平。已有报道认为，弱光有利于愈伤组织的发
生[16], 梨和苹果的实验结果也表明适当的暗培养有
利于不定芽发生[17]。徐凌飞等[18]则认为梨叶片离
体暗培养 20 d 后，再生频率最高。
一般来说，通过器官发生途径再生不定芽时
的出芽方式有两种：一是直接从切口处长出芽，
即不经过愈伤组织诱导阶段，而是直接再生出不
定芽。本文观察到的是连续光下培养的上胚轴多
数用此再生方式。另一是先在切口处形成愈伤组
织，再从愈伤组织上形成绿色芽眼，而后丛生出
多个芽。暗培养后转入光下的上胚轴中有一部分
采用此种再生方式，这和 Moreira-Dias 等[19]用
Troyer 枳橙上胚轴为外植体的结果一致。
另外，我们还观察到，不定梢在附加 N A A
(0.1~1 mg·L-1)的生根培养基中，3 d 后即分化，
约20 d 后可见到不定根的形成。
参考文献
1 邓秀新, 章文才. 柑橘原生质体培养与融合研究. 自然科学进
展——国家重点实验通讯, 1995, 5(1): 35~41
2 邓秀新, 章文才. 柑橘原生质体分离及再生植株的研究. 园
艺学报, 1988, 15(2): 99~102
3 Vardi A, Bleichman S, Aviv D. Genetic transformation of
citrus protoplasts and regeneration of transgenic plants. Plant
Sci, 1990, 69: 199~206
4 邓占鳌, 章文才, 万蜀渊等. 诱发柑橘“适应型”珠心愈
伤组织体细胞胚胎发生的研究. 果树科学, 1991, 8(4):
193~200
5 张进仁, 陈善春, 高峰等. 柑橘细胞悬浮培养及再生植株的
研究. 热带作物学报, 1993, 14(2): 67~70
6 陈大明, 徐昌杰, 张上隆. 柑橘高效离体再生系统研究. 浙江
大学学报(农业与生命科学版), 2000, 26(5): 493~499
7 贺忠群, 段新玲，张卫芳. 金橘上胚轴组织培养及植株再
生. 塔里木农垦大学学报, 2001, 13(2): 23~24
8 贺红, 潘瑞炽, 韩美丽. 枳壳外植体再生及农杆菌介导的遗
传转化. 云南植物研究, 1998, 20(4): 459~463
9 Bordon Y, García-Luis A, Guardiola JL. Genotype affects the
morphogenic response in vitro of epicotyl segments of citrus
rootstocks.Ann Bot, 2000, 86(1): 159~166
10 Moore GA, Jacono CC, Neidigh JL et al. Agrobacterium-
mediated transformation of citrus stem segments and regen-
eration of transgenic plants. Plant Cell Rep, 1992,11: 238~242
11 胡继金, 孔振光. 甜橙完整叶片培养芽直接发生与解剖观察.
果树科学, 1990, 7(2): 81~84
12 Murashige T, Tucker DPH. Growth factor requirements of
citrus tissue culture. Proc First Int Citrus Symp, 1969 (3):
1155~1161
13 贺红, 韩美丽, 何亚文等. 红江橙不同外植体离体培养的研
究. 热带亚热带植物学报, 1997, 5(2): 85~88
14 Pérez-Molphe-Balch E, Ochoa-Alejo N. In vitro plant regen-
eration of Mexican lime and mandarin by direct
organogenesis. Hortic Sci, 1997, 32(5): 931~934
15 王秀琴, 王润珍, 林荣. 金柑组织培养研究. 中国柑橘, 1985,
(1): 19~21
16 陈振光. 园艺植物离体培养学. 北京:中国农业出版社, 1995. 28
17 Leblay C, Chevreau E, Raboin LM. Adventitious shoot re-
generation from in vitro leaves of several pear cultivars
(Pyrus communis L.). Plant Cell Tiss Org Cult, 1990, 25:
99~105
18 徐凌飞, 马锋旺, 王吉之. 梨叶片离体培养和植株再生. 园艺
学报, 2002, 29(4): 367~368
19 Moreira-Dias JM, Molina RV, Bordón Y et al. Direct and
indirect shoot organogenic pathways in epicotyl cuttings of
Troyer Citrange differ in hormone requirements and in their
response to light. Ann Bot, 2000, 85: 103~110