全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第2期，2006年4月268
一种利用ISSR 开发 SSR 引物的方法
郭大龙 罗正荣*
华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉430070
A Method for Development of SSR Primers from ISSR
GUO Da-Long, LUO Zheng-Rong*
Key Laboratory of MOE for Horticultural Plant Biology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
提要 介绍从简单序列重复间区(ISSR)开发微卫星(SSR)引物的方法。该方法分两步: (1)正向引物的分离，即试材 ISSR 扩
增，产物纯化回收并克隆至 T 载体，测序后设计正向引物(引物 1)和巢式引物(引物 2); (2)反向引物的分离，即基因组DNA
酶切并连接接头，结合抑制PCR技术，对产物克隆测序后设计反向引物。应用该方法前人已在多个物种中开发出多对SSR
引物。
关键词 引物开发；ISSR；SSR
收稿 2005-08-26 修定 　2005-11-25
资助 国家自然科学基金(30270925)和高等学校博士学科点专
项科研基金(20030504014)。
*通讯作者(E-mail: luozhr@mail.hzau.edu.cn, Tel: 027-
87282677)。
微卫星(simple sequence repeat, SSR)以1~6 bp
短核苷酸为基本单位，呈串联重复状广布于整个
基因组，具有多态性丰富、易于检测、进化所
受选择压小、以孟德尔方式分离、共显性遗传等
特点。在遗传多样性检测、种质鉴定及系谱分
析、遗传连锁图谱构建、基因定位与标记辅助育
种等领域得到广泛应用。SSR 标记检测的位点多
态性水平明显高于RFLP(限制性酶切片段长度多态
性)，而且重复性优于 R A P D (随机扩增多态性
DNA), 与 AFLP(扩增片段长度多态性)相比，不同
试材所获结论有差异(Powell等1996)。但AFLP是
一种显性标记，不能获得相关位点的详细信息。
由于 SSR 标记在图谱上的丰富性，它已表现出更
大的优势(高志红等2002)。但 SSR 分析时引物的
获得需要预知核酸序列，其广泛应用常受限于从
特定物种中分离SSR 位点的难度和耗费(Hakki 和
Akkaya 2000)。因此，能否开发出足够的适用引
物是SSR应用的关键问题。Zane等(2002)、张增
翠和侯喜林(2004)、李明芳和郑学勤(2004)曾对
SSR 引物开发作过综述。但对利用简单序列重复
间区(inter-simple sequence repeat, ISSR)开发SSR
引物涉及较少，本文拟对该法的原理、步骤及其
效果进行扼要总结。
1 原理
ISSR是Zietkiewicz等(1994)发展起来的一种
基于 SSR 的分子标记。但该法直接利用 SSR 序列
为引物(16~18 bp)，扩增反向排列的间隔不太长
的两个 SSR 之间的序列。为增强扩增产物的特异
性和重复性，常在引物序列的5端和3端分别锚
定1~4 个选择性碱基，从而避免 SSR 在基因组上
滑动。一套 ISSR 引物可通用于不同物种。
ISSR扩增产物克隆测序后，因重复序列核心
所在区域，亦即重复单元(SSR)通常在所测序列的
两端(Fisher等 1996)，故一般只能得到SSR一端
的引物。为了获得另一端的引物，须采用染色体
步行法，进行第 2 次克隆、测序和设计引物。染
色体步行主要有载体PCR (vectorette PCR) (Arnold
和 Hodgson 1991；Lench等 1996；Ujino等 1998)
和抑制PCR (Siebert等1995) 2种途径。
Lian等(2001)和Burgess等(2001)分别提出一
种ISSR 与抑制 PCR 相结合分离 SSR 位点的方法，
并在松树(Lian 等 2000)、刺槐(Lian 和 Hogetsu
2002)、柳树(Lian等2003)、白桦木(Wu等2002)、
豆马勃(Kanchanaprayudh 等 2002)和结球白菜
(Tamura 等 2005)等植物上获得成功。有关抑制
PCR技术的原理，可参见Siebert等(1995)和周炜
等(1999)的叙述。
2 操作步骤
利用ISSR开发SSR引物通常包括分离正向和
反向引物两个步骤。
正向引物的开发流程见图 1。根据我们的经
验，当 ISSR 扩增片段的特异性较高、亮度较强
时，对扩增产物回收后克隆、测序效果较好；扩
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增片段较多时，选用 PCR 产物直接克隆的效果更
好，但对载体和菌株感受态的质量要求较高。通
常在序列两端，有时在序列内部也存在 SSR。若
序列内 S S R 两端序列足够长时也可直接设计引
物。但一般需要在测序的基础上，设计正向引物
(引物1)和正向巢式引物(引物2)，并进行染色体
步行以分离反向引物。
根据我们的经验，较长的引物序列和较高的
退火温度对抑制 PCR 引物设计尤为关键。特异性
较强的引物序列长度通常达到27~28 bp，引物 Tm
值设计为 65~68℃。此外，还需要对引物序列进
行酶切位点分析。
反向引物的分离过程稍显复杂(图2)。首先，
选用几种平端酶切位点的酶对基因组 DNA 进行酶
切，常用的有HaeIII、EcoRV、SspI 和 AluI 等。
其次，接头选用对抑制 PCR 扩增效果影响较大。
在我们的试验中，Diatchenko等(1996)所用的接头
较Lian等(2001)的抑制效果更佳。此外，Lian等
(2001)对酶切产物进行了纯化，但根据我们的经
验，只要在酶切后针对不同的酶实行高温灭活即
可连接接头，连接产物一般稀释10倍即可进行抑
制 P C R 扩增。
第1轮扩增的退火温度一般为62℃，正向引
物(引物1)和接头引物1 (AP1)的扩增结果应为一片
弥散区域(图3)。将扩增产物稀释50或100倍后，
用巢式引物(引物2)和接头引物2 (AP2)在相同条件
下进行第2轮扩增，应获得特异性的清晰谱带(图
3)。回收该谱带，克隆、测序后，即可设计 SSR
引物。有时需要选用不同的平端酶以及进一步设
计正向引物和巢式引物才能获得理想的结果。
3 效果和评价
用基因组文库开发10个SSR引物至少需要鉴
定38个SSR克隆和设计20对SSR引物(Sdquirrell
等 2003)。Lian 等(2003)在松菇(Tricholoma
matsutake)中采用ISSR和抑制PCR开发出10对SSR
引物，其中6对具有多态性。Burgess等(2001)在
松球壳孢菌(Sphaeropsis sapinea)中用同样方法开发
出21 对引物，其中 15 对多态性较丰富。Tamura
等(2005)也在结球白菜(Brassica rapa)中开发出54
对引物，51对具有多态性。van der Nest等(2000)
图3 抑制PCR第1轮和第2轮扩增结果
M: DL 2000分子量标准; a: 第1轮扩增产物(引物1和接头
引物1); b1, b2: 第2轮扩增产物(引物2和接头引物2)。接头
引物 1: 5 TGTAGCGTGAAGACGACAGAA 3; 接头引物 2:
5 AGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT 3 (序列信息引自 Diatchenko
等 1996)。
图1 正向引物开发流程
引自 Acquadro 等(2005)并作修改。
图2 反向引物开发流程
引自Acquadro 等(2005)并作修改。AP1: 接头引物 1; AP2:
接头引物 2 。
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在桉树中成功获得 SSR 引物，测序结果表明其扩
增区域为重复序列。我们用该方法成功开发出12
对柿属植物SSR引物，在供试的6种 30个基因型
的 SSR-PCR 扩增中均获得清晰的谱带(待发表)。
通过公共数据库或者文献获得SSR 引物序列
最为简便易行。但对于大部分物种而言，其数量
有限。而且在不同物种间共用 SSR 引物，有时盲
目性较大，可指导操作的理论依据不足(Brown等
1996)。此外，通过基因组文库获得 SSR 引物序
列成本高，效率低，工作量大(Sdquirrell 等
2003)。从 ISSR 获得 SSR 引物，对于缺乏引物序
列信息的物种而言，应是一条简便有效的途径。
利用 ISSR 筛选 SSR 引物，在植物、动物、
微生物和真菌中都已有成功的报道。因其只瞄准
SSR 区域，针对性强，可免去杂交筛选步骤。由
于ISSR 引物通用性强，组合很多，只要抑制PCR
引物设计合适，获得的每个片段均满足 SSR 引物
设计所要求的序列长度。因此，有望在 SSR 引物
开发中得到广泛应用。
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