全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月 923
基于分子杂交和单分子PCR 的同源基因克隆技术
陈喜文1 刘晓光2 陈德富1,* 陈飞雪1
1 南开大学生命科学学院，天津 300071；2 内蒙古商法学院，呼和浩特 010010
Homology Cloning Based on Molecular Hybridization and Single Molecular
PCR
CHEN Xi-Wen1, LIU Xiao-Guang2, CHEN De-Fu1,*, CHEN Fei-Xue1
1College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China; 2Inner Mongolian College of Business and Law, Hohhot
010010, China
提要 文章以拟南芥谷胱甘肽 -S- 转移酶 Zeta 类(GSTZ)基因为饵基因，建立了一种基于分子杂交和单分子 PCR 的同源基
因克隆新方法。获得的 6 个甘蓝型油菜 GSTZ 全长 cDNA 克隆中，有 5 个与 GenBank 注册序列(AY208158)完全相同。
关键词 同源克隆；全长 cDNA；分子杂交；单分子 PCR；谷胱甘肽 -S- 转移酶 Zeta 类
收稿 2006-05-09 修定 　2006-08-17
资助 国家自然科学基金(30671183)、天津市自然科学基金
(043606711)、教育部留学回国人员科研启动基金
(2003-406)和南开大学 2004 年度科技创新基金。
*通讯作者(E-mail: chendefu@nankai.edu.cn, Tel: 022-
23500133)。
基因克隆技术中代表性的方法主要有：根据
现有基因序列的同源克隆(homology cloning)、根
据基因表达产物的功能克隆(functional cloning)
( B o g a n 等 2 0 0 3 )、根据连锁图谱的定位克隆
(positional cloning)或图位克隆(map-based cloning)
(Arondel 等 1992)以及根据表型差异的表型克隆
(phenotype cloning) (Jonsson和Weissman 1992)。
随着基因克隆技术的发展，克隆的基因数逐年呈
指数增长，但各种方法都各有其局限性，所以人
们总是期待基因克隆技术不断发展和完善。
单分子PCR (single molecular PCR，SM-PCR)
是Ohuchi等(1998)建立起来的一种极端条件下的
PCR 技术，模板 DNA 低至每反应管仅 1 个或数个
分子，循环数增至70~80个，所以1个或数个DNA
模板分子可增至 mg级可操作水平。分子杂交技术
可将可配对的 2 条单链核酸分子退火形成双链杂
合分子，条件改变后杂合双链可变性成2条单链。
谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferases,
GSTs, EC.2.5.1.18) Zeta类(GSTZ)是一种多功能酶
(Chen 等 2003)，本文以其基因为试验材料，建
立了一种基于分子杂交和单分子 PCR 的同源基因
克隆新方法。方法是以拟南芥 GSTZ 基因为饵基
因，将其固定于硝酸纤维素膜上，与含靶基因的
甘蓝型油菜总 cDNA 杂交，然后以其洗脱液为模
板进行单分子PCR 扩增，获得了甘蓝型油菜GSTZ
基因全长 c D N A。
材料与方法
1 材料
1.1 植物材料 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品系
‘垦C1’ (陕西农垦科研中心李殿荣先生惠赠)和拟
南芥(Arabidopsis thanliana)生态型‘Columbia gl1’
(本室保存)种植在温度为25℃、光照15 h/黑暗9
h 的人工气候箱中。幼叶至二叶期时，取其幼叶
提取总 RNA，提取的总 RNA 用 4 mol·L-1 尿素变
性的1.25%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性(陈德富
等 1999)。
1.2 菌株与质粒 大肠杆菌菌株DH5a-FT为本室保
存，载体pMD-18T 购自宝生物工程(大连)有限公
司。
1.3 试剂与培养基 Taq DNA聚合酶、T4 DNA连
接酶等购自宝生物工程(大连)有限公司，硝酸纤
维素膜购自日本 Toyo 公司，蓝色葡聚糖 2000 购
自 Pharmacia 公司，引物合成由北京三博远志生
物技术有限责任公司完成，其它试剂均为国产分
析 纯 。
技术与方法 Techniques and Methods
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2 方法
2.1 总 RNA 提取及全长双链cDNA 扩增 幼叶总
RNA 提取、poly(A) + mRNAs 分离、全长单链
cDNA 合成参见 Chen 等(2003)方法。扩增全长双
链 cDNA 单引物(IIA)的序列：5 AAGCAGTGG-
TATCAACGCAGAGT 3。100 mL 扩增体系中含10
mL 10×Advantage 2 PCR缓冲液、2 mL 10 mmol·L-1
dNTP、2 mL 10 mmol·L-1引物IIA、4 mL 全长单
链cDNA 及 2 mL 50×Advantage 2 聚合酶混合物
(Clontech公司)。PCR参数设为95℃预变性1 min
后进行 20个三温度循环(95℃变性 15 s、65℃退
火 30 s、68℃延伸 6 min)。
2.2 饵基因DNA扩增 依据GenBank注册的拟南芥
GSTZ基因序列(AY208155)设计扩增其开放阅读框
的引物对：A-1 (5 ATGGCGAATTCCGGCGA 3)和
A-2 (5 TCAGATGGTGGAAGAAGGAGCA 3)，以
拟南芥全长双链 c D N A 为模板，扩增饵基因
AtGSTZ。100 mL 扩增体系中含10 mL 10×PCR 缓
冲液、8 mL 2.5 mmol·L-1 dNTP、3 mL 10 ng·mL-1
拟南芥cDNA、1.25 mL 10 mmol·L-1引物A-1、1.25
mL 10 mmol·L-1引物A-2及0.5 mL 5 U·mL-1 Taq DNA
聚合酶。PCR 参数设为94℃预变性5 min 后进行
35个三温度循环(94℃变性40 s、60℃退火32 s、
72℃延伸 1.5 min)。然后电泳法回收目的 DNA，
并调整其终浓度至 15 ng ·mL -1，然后分别溶于
TE、无菌水或含1.5 mol·L-1 NaOH和 0.5 mol·L-1
NaCl 的变性液中，沸水浴中保温 5 min 后骤冷。
2.3 印迹膜制作 剪取(2.5~3) mm×(2.5~3) mm的硝
酸纤维素膜数枚，浸于 AtGSTZ DNA 变性液中，
期间不时摇动，30 min后将膜转至含200 ng·mL-1
变性鲑精 DNA、5×SSPE、5×Denhardt 和 0.5%
SDS 的封闭液中，65℃杂交 24 h 后用 5×SSPE 和
0.1% SDS各洗膜1次，然后紫外交联2 min、80℃
烤膜 30 min。
2.4 单分子PCR体系的建立 参照Ohuchi等(1998)
方法用 0.1% 蓝色葡聚糖2000 稀释纯化的AtGSTZ
至最终浓度10 (分子)·mL-1 (1分子AtGSTZ质量为
7.3×10-10 ng)。10 mL PCR体系中含1 mL 10×PCR
缓冲液、1 mL 2.5 mmol·L-1 dNTP、1 mL 10 (分子)·
mL-1 AtGSTZ、0.25 mL 10 mmol·L-1引物A-1、0.25 mL
10 mmol·L-1引物A-2及0.05 mL 5 U·mL-1 Taq DNA
聚合酶。PCR 参数为 94℃预变性 5 min 后进行三
温度循环(94℃变性20 s、60℃退火10 s、72℃延
伸80 s)。为优化PCR参数，以3~4次重复实验的
目的带的相对亮度的平均值为依据评价扩增体系。
2.5 靶基因克隆 取1枚印迹膜浸于20 ng·mL-1甘蓝
型油菜全长双链cDNA中，沸水浴中保温5 min后
骤冷，然后加等体积杂交缓冲液( 1 0 ×S S P E 、
10×Denhardt 和 1% SDS)，65℃反应 36 h，再用
65℃预热 2×SSC和 0.1% SDS、1×SSC和 0.1% SDS
各洗膜3次，每次20 min，再将膜转至40 mL 0.1%
蓝色葡聚糖2000 溶液中，100℃下保温5 min 后
冰上骤冷，取上清液为模板，按优化的 10 mL
AtGSTZ 单分子 PCR 体系进行扩增，引物为扩增
全长双链cDNA 用的单引物IIA，循环数为70个。
PCR 完毕后用电泳法回收目的带，回收的 DNA 与
载体 pMD18-T 连接后转化进大肠杆菌 DH5a-FT，
以蓝白斑筛选、质粒 PCR 和限制性内切酶等法筛
选的阳性克隆送北京三博志远生物技术有限责任公
司测序。
实验结果
1 全长双链cDNA扩增
拟南芥与甘蓝型油菜幼叶于液氮中研磨后迅
速用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen公司)提取总
RNA，尿素变性琼脂糖凝胶电泳证明，提取的总
R N A 完整性好，未发生降解( 图 1 ) 。进而用
polyATract mRNA 分离系统(Promega 公司)从总
RNA 中富集出 poly(A)+ mRNA，再用 Smart PCR
cDNA 合成试剂盒(Clontech 公司)合成全长 cDNA
第 1 链，最后用单引物(IIA) PCR 合成双链全长
cDN A。图 2 是双链 cD N A 扩增的结果，明显呈
拖尾状，拖尾区间介于0.4~8 kb之间，表明扩增
的拟南芥与甘蓝型油菜双链 cDNA 是完全的，可
用于基因全长 cD N A 克隆。
2 饵基因 DNA 扩增、印迹膜的制作及杂交条件
的优化
以A-1 和 A-2 为引物对，以拟南芥全长双链
cDNA 为模板，扩增得到长为 666 bp 的 GSTZ 开
放阅读框，将其命名为 AtGSTZ。电泳回收目的
片段，热变性后转移至硝酸纤维素膜上，制作的
印迹膜与甘蓝型油菜 cDNA 杂交，再以洗脱液为
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模板进行单引物(IIA)单分子 PCR，扩增未知的甘
蓝型油菜 GSTZ 基因(BnGSTZ)。
对实验过程中关键步骤进行条件优化的结果
显示，用 NaOH 变性液溶解饵基因 DNA 是实验成
功的关键。当 AtGSTZ DNA 溶于 TE 或无菌水中，
其洗脱液扩增不出目的带；若溶于 NaOH 变性液
中，则可以见到明显的目的带(图3，泳道1)。造
成其差异的原因可能是溶于TE或无菌水中的热变
性 AtGSTZ DNA 多已复性，以致没有足够饵基因
DN A 固定于膜上而导致扩增失败。
实验结果还显示，采用封闭液与否也影响实
验结果。未经封闭液处理的印迹膜与甘蓝型油菜
cDNA 杂交后，其洗脱液扩增不出目的带。造成
这种现象的原因可能是膜上存在未固定 AtGSTZ
DNA 的空区，以致甘蓝型油菜 cDNA 直接共价结
合于膜上无法洗脱下来。
杂交时的温度对实验结果影响也很大。从图
3 可以看出，在 6 5℃下杂交可见到明显的目的
带；55 和 75℃下杂交均未见到明显目的带。推
测造成差异的原因是低温下杂交易出现非特异性杂
交而阻碍膜上的 AtGSTZ DNA 与溶液中的 BnGSTZ
c D N A 结合；高温影响杂交时溶液中的 BnG S T Z
cDNA 与膜上的AtGSTZ DNA 结合，以致扩增失败。
图1 总RNA变性琼脂糖凝胶电泳图谱
A ：拟南芥总 R N A ；B ：甘蓝型油菜总 R N A 。
图2 扩增的双链cDNA琼脂糖凝胶电泳图谱
M：D N A 标准分子量标记；A ：拟南芥双链 c D N A ；B ：
甘蓝型油菜双链 c D N A 。
图3 杂交时的温度对目的条带扩增的影响
M ：D N A 标准分子量标记；1 ：6 5 ℃下杂交条带；2 ：
5 5℃下杂交条带；3：7 5℃下杂交条带。箭头所指条带为甘
蓝型油菜 BnGSTZ，长约 1 kb。
3 单分子PCR体系建立
以每管含10个分子 AtGSTZ为模板进行PCR，
比较不同循环数对目的带相对亮度影响的结果(图
4)表明，65个循环以下的目的带亮度随循环数增
加而增加；65~75 个循环的目的带亮度不再随循
环数增加而增加；75个循环以上的目的带亮度随
循环数增加反而减弱。因此认为65个循环是10个
分子 AtGSTZ PCR 的最适循环数，65~75 个循环
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的扩增量可能因 dNTP、引物或 Taq DNA 聚合酶
已耗尽而不再增长，80个循环以上的扩增可能因
扩增产物发生不可逆变性而减少。实验中还见到
3种温度循环中的不同变性和退火时间也影响扩增
量，其中以20 s变性和10 s退火扩增出的目的带
最 亮 。
配对序列，因此无法通过蓝白斑和 P C R 方法剔
除。
讨　　论
同源基因克隆通常采用DNA 保守域简并引物
PCR 等策略，但由于简并引物 PCR 克隆的特异性
低，实验流程长，实验要求严格，因而有时难
以达到克隆目的。此外，简并引物 P C R 克隆仅
能获得基因的片段，而且还需结合 RACE 技术才
可以获得全长序列；当已知的同源基因很少时，
难以发现可用于设计简并引物的 DNA 保守域以致
该克隆策略无法采用。本文建立的同源克隆技术
通过分子杂交方法从全长总cDNA中将需要克隆的
同源靶基因 cDNA 一次性分离出来，然后以通用
单引物 IIA 为引物进行单分子 PCR，扩增其洗脱
液中的微量靶基因全长 cDNA，能有效地获得任
何需要克隆的同源靶基因。
为确保克隆到靶基因全长 cDNA，本文使用
了Clontech公司的Smart PCR cDNA Synthesis Kit。
本试剂盒利用SMART原理(switching mechanism at
5 end of the RNA transcript)合成基因全长cDNA，
要求其mRNA 的 5 末端必须含甲基化鸟嘌呤及3
末端必须含多聚腺嘌呤，5末端不是鸟嘌呤和3
末端不是poly(A)+ 的 mRNA 则合成不出全长cDNA
(Zhu等2001)。植物细胞中约2/3蛋白质基因转录
本的5末端含甲基化鸟嘌呤和3末端含poly(A)+
m R N A，因此本文中的同源克隆策略对大多数植
物蛋白质基因克隆来说可能是有效的。
本文的同源克隆策略中采用了分子杂交技
术，其原理是碱基互补，同源性越高，获取杂
合双链分子的可能性就越大，因此同源性高的饵
基因 DNA 的选取和共价结合有饵基因 DNA 印迹膜
的制作是这项同源克隆技术成功的关键。若选取
同源性低的饵基因，虽可采用低杂交温度或更多
单分子 P C R 循环数来弥补，但实验显示，过低
的杂交温度导致非同源 DNA 污染，其筛选难度会
增大。另外，过多的循环数又可能因扩增产物的
不可逆变性而导致目的 DNA 量的减少。我们在实
验中还见到，制作印迹膜时的饵基因 DNA 变性是
否彻底以及膜上空区是否封闭完全等因素也会影响
实验结果。
4 同源靶基因克隆与分析
取1枚AtGSTZ印迹膜浸于甘蓝型油菜全长双
链cDNA 溶液中，杂交完毕后将膜转至 0.1% 蓝色
葡聚糖 2000 溶液中，热变性后骤冷，取上清液
进行单分子 PCR 扩增。以扩增全长双链 cDNA 用
的单引物 IIA 为扩增引物，循环数为 70。扩增
DNA (图3，泳道1箭头所示)经电泳分离和回收后
与载体 pMD18-T 连接并转化进大肠杆菌，选取经
蓝白斑、PCR 和限制性内切酶等法鉴定的 6 个阳
性克隆进行序列测定。序列分析显示，其中 5 个
与我们在前文(Chen等 2003)中采用简并引物PCR
结合 RACE 技术克隆的 BnGSTZ 全长 cDNA 序列
(AY208158)完全相同，表明基于分子杂交和单分
子 PCR 建立的同源克隆技术能够克隆到靶基因全
长 cDN A，成功率高(8 3 % )。序列分析也表明，
其中1个克隆(占 17%)为来源不明的非同源 DNA，
暗示实验中可能有一定程度的污染，由于此种污
染的 DNA 与靶基因长度接近，两端也含引物 IIA
图 4 单分子PCR 循环数对目的DNA扩增量的影响
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在单分子PCR 中，由于模板数的减少和循环
数的增加，实验难度比常规 PCR 要明显增大，这
主要表现为更易产生二聚体，更易出现污染和更
易发生突变(杨鹏等 2005)。本文中也见到循环
数、变性时间以及退火时间对单分子 PCR 结果的
影响很大，过多或过少的循环数、变性时间和退
火时间都可能导致实验失败，因此在同源克隆中
应优化单分子 P C R 体系，严格实验操作，并用
高保真 D N A 聚合酶。
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