全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月 717
盐地碱蓬液泡膜Ca2+/H+ 逆转运蛋白SsCAX1 N末端原核表达和多克隆抗
体的制备
韩宁1,2 邵群1 王宝山1,*
1 山东师范大学生命科学学院，济南 250014；2 山东轻工业学院食品与生物工程学院，济南 250100
Prokaryotic Expression of the Vacuolar Ca2+/H+ Antiporter SsCAX1 N-termi-
nal and Its Polyclonal Antibody Preparation of Suaeda salsa L.
HAN Ning1,2, SHAO Qun1, WANG Bao-Shan1,*
1College of Life Science, Shandong Normal University, Jinan 250014, China; 2College of Food and Biologic Engineering, Shandong
Institute of Light Industry, Jinan 250100, China
提要 采用 PCR 技术，从盐地碱蓬液泡膜 Ca2+/H+ 逆转运蛋白 SsCAX1 的 cDNA 中扩增了其 N 末端亲水区段(1~210 bp)，
并将其插入到原核表达载体 pGEX-6p-3 中进行诱导表达。获得分子量约 33.5 kDa 的可溶性融合蛋白，经纯化后从免疫家
兔中得到了 SsCAX1 的特异性抗体。
关键词 盐地碱蓬；液泡膜 SsCAX1；原核表达；多克隆抗体制备
收稿 2006-02-28 修定 　2006-05-08
资助 教育部高等学校博士学科点专项科研基金(20050445003)
和山东省自然科学基金重点项目(Z2004D03)。
*通讯作者(E-mail: bswang@sdnu.edu.cn, Tel: 0531-
86180197)。
Ca2+ 是植物维持正常生命活动的必需元素之
一。自然界中很多胁迫因子如干旱、盐渍、低
温等都能引起植物胞质中游离Ca2+浓度的升高(章
文华等2000)。胞质游离Ca2+是重要的信号转导分
子，通过细胞质中自身浓度的变化进行信号转
导，从而使细胞做出相应的反应( S a n d e r s 等
1999)。为了不影响细胞正常的代谢，维持刺激
时和刺激后胞质中游离 Ca2+ 浓度的稳态是非常重
要的。液泡约占成熟植物细胞体积的 90%，是细
胞内储存Ca2+ 的主要场所。液泡对胞质中Ca2+ 浓
度变化和稳态的维持有重要作用。外界刺激作用
细胞后，液泡膜上的 Ca 2+ 通道能将 Ca 2+ 运出液
泡，增加胞质中Ca2+浓度，而Ca2+-ATPase和Ca2+/
H+ 逆向转运体能将Ca2+ 运入液泡，从而将胞质中
增多的 Ca2+ 迅速区隔到液泡中以维持胞质中 Ca2+
的稳态，而保护细胞的正常代谢( S a n d e r s 等
1999)。而且有些研究者认为，液泡Ca2+/H+ 逆转
运蛋白对胞质中突然增多的 Ca2+ 的迅速区隔化更
有效(Hirschi 2001)。
目前，从拟南芥、玉米等非盐生植物中已克
隆到 Ca2+/H+ 逆向转运体(antiporter)基因 CAX
(cation exchanger)，并初步分析了CAX与植物抗
盐性的关系(Hirschi 1999)。最近，我们实验室从
真盐生植物盐地碱蓬(Suaeda salsa L.)中也克隆到
与拟南芥CAX1有同源性的基因SsCAX1 (GenBank
注册号为AY 518204)，并对其基因表达特性做了
分析( 另文发表) 。我们在 S s C A X 1 的 N 末端
(D1~70)设计了一对特异引物，采用 PCR 技术克
隆了SsCAX1 cDNA开放阅读框5端 210 bp片段。
构建了 SsCAX1 原核表达载体，并以表达的融合
蛋白为抗原制备了 SsCAX1 的多克隆抗体。这些
结果为进一步研究 SsCAX1 蛋白亚细胞定位、功
能分析及其在植物抗逆中的作用奠定了基础。
材料与方法
1 材料
原核表达载体为 pGEX-6p-3，感受态菌株
BL21 (DE3)。盐地碱蓬(Suaeda salsa L.) SsCAX1
蛋白的 cDNA 由本实验室克隆、保存。实验兔为
纯种新西兰雄性兔，购自山东省农业科学院。
2 引物设计与合成
在SsCAX1 cDNA的 Ca2+/H+ 逆向转运蛋白N末
端 1~70 氨基酸处设计了一对引物：P1 (上游引
物)，5 GTAGGATCCGAGTCGTGTAGTAGA 3
(划线处为BamHI位点); P2 (下游引物)，5 GCA-
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CTCGAGTTAGACTTCTTGTAGGTT 3 (划线处为
XhoI位点)。在P1、P2引物的5端分别引入BamHI和
XhoI识别位点，引物由上海博亚生物工程公司合成。
3 工具酶及试剂
EX TaqTM、限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、
DNA分子量标记均购自Takara公司；还原型谷胱
甘肽、IPT G、蛋白分子量标记、碱性磷酸酶标
记的羊抗兔购自北京华美生物工程公司；谷胱甘
肽琼脂糖凝胶4B (Glutathione Sepharose 4B)购自
Pharmacia公司；弗氏佐剂购自上海生物工程公司。
4 PCR 扩增及表达载体构建及 DNA 测序等基因
操作
按文献(Sambrook 等 1989)方法进行。
5 重组质粒在大肠杆菌中的表达　
重组质粒 pGEX-SsCAX1D1~210 转化大肠杆菌
BL21 (DE3)，挑取阳性单菌落，37℃振荡培养过
夜，次日，以 1:100 的体积比接种于另一新鲜的
LB液体培养基中，继续培养至OD600 约为 0.6，用
终浓度为0.4 mmol·L-1 IPTG 30℃诱导3 h，离心
收集菌体。
6 菌体超声裂解液制备及GST-SsCAX1D1~70 融合
蛋白的纯化
将离心收集的菌体重悬浮于预冷的磷酸缓冲
液(PBS，pH 7.3)，冰浴下超声破碎细胞。离心
后收集上清过谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B层析柱，磷
酸缓冲液(pH 7.3)充分洗脱至基线。然后用5~10
倍柱床体积的还原型谷胱甘肽洗脱，浓缩收集成
分即为纯化的 GST-SsCAX1D1~70。用 SDS-PAGE 电
泳检测纯化产物，分离胶浓度为1 2 %。
7 蛋白质含量测定
参照Bradford (1976)的方法。
8 GST-SsCAX1D1~70 抗血清的制备及效价检测
参考Catty (1988)的方法。
9 碱蓬液泡膜的制备
参照 Wang 等(2000)的方法。
10 Western印迹
参照Fischer-Schliebs等(1997)的方法。
实验结果
1 pGEX-SsCAX1D1~210 表达质粒构建
用设计的SsCAX1 cDNA 阅读框 1~210 bp 的
5 端及 3端引物，从SsCAX1 cDNA 的 5 末端扩
增出约210 bp 的 DNA 片段(图 1)，与预期片段长
度相符。产物回收后，利用引物所引入的 BamHI
和 XhoI位点，将其装入原核表达载体pGEX-6p-3
的 B a m H I 和 X h o I 位点，转化大肠杆菌 B L 2 1
(DE3)，挑选阳性克隆，经测序鉴定，构建的重
组分子 pGEX-SsCAX1D1~210 阅读框正确。
图2 GST-SsCAX1D1~70 融合蛋白诱导产物的 SDS-PAGE
1：大肠杆菌 BL21 (DE3) pGEX-SsCAX1D1~210 的诱导全菌
蛋白；2：大肠杆菌 BL21 (DE3) pGEX-6p-3 的诱导全菌蛋
白；M ：蛋白质分子量标准。
图1 盐地碱蓬SsCAX1 cDNA 5 端片段的PCR扩增
1：SsCA X 1 c D NA 5 端；M：DNA 标准分子量 DL20 0 0。
2 融合蛋白的诱导表达
对IPTG诱导后的大肠杆菌BL21 (DE3)的细胞
粗提物进行 SDS-PAGE 电泳检测的结果(图 2)可
见，大肠杆菌 BL21 (DE3) pGEX-SsCAX1D1~210 在
33.5 kDa附近出现高水平表达的蛋白条带，与预
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期的融合蛋白GST-SsCAX1D1~70 分子量一致，而大
肠杆菌BL21 (DE3) (pGEX-6p-3)在相同分子量部
位没有相应的蛋白条带，只在26.0 kDa的位置出
现了 GST 蛋白的特异条带，表明插入的外源基因
片段已经成功地在大肠杆菌中表达，并与 GST 形
成了融合蛋白。
3 GST-SsCAX1D1~70 融合蛋白的纯化
将BL21 (DE3) pGEX-SsCAX1D1~70 诱导后的菌
体进行超声波破碎、离心。沉淀和上清液分别进
行 SDS-PAGE，见到融合蛋白主要存在于上清液
中，说明融合蛋白以可溶蛋白的形式存在于细胞
中(图3)。菌体超声裂解液经谷胱甘肽琼脂糖凝胶
4B层析柱纯化后，得到高纯度的GST-SsCAX1D1~70
表达蛋白(图 4)。
4 抗体的特异性分析
以亲和纯化的GST-SsCAX1D1~70 为抗原制备的
盐地碱蓬SsCAX1抗血清，其效价达1:500 (结果
未列出)。Western印迹实验表明，制备的抗体与
盐地碱蓬液泡膜微囊中 48~50 kDa 的蛋白杂交，
而盐地碱蓬质膜微囊中蛋白质无杂交印迹(图 5)，
与推测的SsCAX1 的分子量相当(48.8 kDa)。
讨 论
在盐胁迫下，植物液泡膜Ca2+/H+逆向转运蛋
白在Ca2+信号转导中起重要作用(Hirschi 2001)，
它不仅负责维持胞质中 Ca2+ 的稳衡态，而且它的
活性大小还影响盐信号的有效转导。目前，Ca2+/
H+ 逆向转运蛋白的研究主要来源于拟南芥和玉米
等非盐生植物，盐生植物中尚无报道。盐生植物
能在高盐环境中生长发育并完成生活史，而非盐
生植物则不能。盐生植物和非盐生植物在 K +、
Na+ 的吸收、运输、区域化和外排及 Ca2+ 信号等
方面的差别可能是它们抗盐性不同的关键(Munns
2005)。盐地碱蓬为石竹目藜科碱蓬属一年生草本
植物，属于我国特有的高耐盐真盐生植物，主要
分布在我国长江以北海滩和内陆重盐碱地地区，
在 NaCl 含量在 0.2%~4.5% 的土壤上正常开花结
实。盐地碱蓬营养成分全，鲜嫩茎叶富含蛋白
质、维生素、铁、硒，种子含亚油酸，在食
用、饲料、药用、生态保护等方面具有开发价
值。我们曾报道盐胁迫下盐地碱蓬的液泡膜V-H+-
ATPase活性增加依赖于Ca2+ (Han等2005)。因此，
盐生植物与非盐生植物液泡膜Ca2+/H+逆向转运蛋
白结构和活性的区别及其与抗盐的关系值得探讨。
SsCAX1 蛋白属于跨膜蛋白，具有 11 个跨膜
区，N 末端 D1~70 区段是亲水区且与其它植物的
同源性较低(另文发表)，因此，选择此区进行原
图4 纯化的 GST-SsCAX1D1~70 融合蛋白 SDS-PAGE 分析
1：纯化的 GST-SsCAX1D1~70 融合蛋白；M：蛋白质分子量标准。
图3 大肠杆菌BL21 (DE3) pGEX-SsCAX1D1~70诱导后的
菌体经超声波破碎的上清液和沉淀的 SDS-PAGE 分析
1 ：上清液；2 ：沉淀；M ：蛋白质分子量标准。
图5 盐地碱蓬液泡膜SsCAX1的Western印迹分析
1：液泡膜蛋白；2：质膜蛋白。每泳道蛋白上样量为 30 mg。
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核表达以制备抗体是可行的。这比用人工合成肽
段制备 CAX 类抗体的费用低(Hirschi 等2000；
Ueoka-Nakanishi等1999)。
实验构建的表达质粒pGEX-SsCAX1D1~210 结构正
确，未出现突变及移码现象。pGEX-SsCAX1D1~210
在 IPTG 诱导下可稳定、高效表达融合蛋白，且
以可溶性蛋白存在于大肠杆菌中。Western印迹实
验表明，制备的抗体可以与盐地碱蓬液泡膜囊泡
中48~50 kDa 的蛋白杂交，而质膜中无此带，这
与推测的盐地碱蓬液泡膜 SsCAX1 的分子量相当，
说明 SsCAX1 定位于液泡膜，所制备的 SsCAX1
抗体具有较高特异性。
本文成功地从真盐生植物盐地碱蓬中制备了
特异性较高的 SsCAX1 多克隆抗体，为进一步研
究 SsCAX1 蛋白的亚细胞定位、功能分析及其在
植物抗逆中的作用奠定了基础。
参考文献
章文华, 陈亚华, 刘友良(2000). 钙在植物细胞盐胁迫信号中的
作用. 植物生理学通讯, 36: 146~153
Bradford MM (1976). A rapid and sensitive method for the
quantitation of microgram quantitative of protein utilizing
the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72:
248~254
Catty D (1988). Antibodies: A Practical Approach. Oxford,
Washington DC: IRL Press
Fischer-Schliebs E, Ball E, Berndt E, Besemfelder-Butz E, Binzel
ML, Drobny M, Mühlenhoff D, Müller ML, Rakowski K,
Ratajczak R (1997). Differential immunological cross-reac-
tions with antisera against the V-ATPase of Kalanchoë
daigremontiana reveal structural differences of V-ATPase
subunits of different plant species. Biol Chem, 378:
1131~1139
Han N, Shao Q, Lu CM, Wang BS (2005). The leaf tonoplast V-
H+-ATPase activity of a C3 halophyte Suaeda salsa is
enhanced by salt stress in a Ca-dependent mode. J Plant
Physiol, 162: 267~274
Hirschi KD (1999). Expression of Arabidopsis CAX1 in tobacco:
altered calcium homeostasis and increased stress sensitivity.
Plant Cell, 11: 2113~2122
Hirschi KD (2001). Vacuolar H+/Ca2+ transport: who’s directing
the traffic? Trends Plant Sci, 6: 100~104
Hirschi KD, Korenkov VD, Wilganowski NL, Wagner GJ (2000).
Expression of Arabidopsis CAX2 in tobacco. Altered metal
accumulation and increased manganese tolerance. Plant
Physiol, 124: 125~134
Munns R (2005). Genes and salt tolerance: bringing them together.
New Phytol, 167: 645~663
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989). Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2nd ed. New York, CSH: Cold Spring
Harbor Laboratory Press
Sanders D, Brownlee C, Harper JF (1999). Communicating with
calcium. Plant Cell, 11: 691~706
Ueoka-Nakanishi H, Nakanishi Y, Tanaka Y, Maeshima M (1999).
Properties and molecular cloning of Ca2+/H+ antiporter in the
vacuolar membrane of mung bean. Eur J Biochem, 262:
417~425
Wang BS, Ratajczak R, Zhang JH (2000). Activity, amount and
subunit composition of vacuolar-type H+-ATPase and H+-
PPase in wheat roots under severe NaCl stress. J Plant
Physiol, 157: 109~116