全 文 ：植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月 65
以茎尖组培苗检测甘蔗体内内生固氮菌的固氮活性
王伦旺1，李杨瑞2,*，何为中1，贤武1，梁俊1，谭裕模1
1 广西壮族自治区甘蔗研究所，南宁530007；2广西壮族自治区农业科学院作物遗传改良生物技术重点开放实验室，南
宁530007
提要：以巴西引进的甘蔗品种‘B1’、‘B3’、‘B5’、‘B8’以及广西地区栽培品种‘新台糖16号’和‘桂糖11号’的
茎尖进行组织培养，对其继代4次的茎尖组培苗进行有氮与无氮培养比较以及于温室中无氮盆栽品种比较试验的结果表
明，经茎尖培养的甘蔗品种其原有的固氮能力不丧失，4个巴西甘蔗品种的固氮能力和在无氮下的生长能力强于广西主栽
品种‘新台糖16号’和‘桂糖11号’，无氮培养的巴西甘蔗品种氮含量较高，固氮活性较强，缺氮症状出现时间较迟；
无氮盆栽的巴西甘蔗品种株高、分蘖、叶片的固氮活性等均优于‘新台糖16号’和‘桂糖11号’。
关键词：茎尖培养；生物固氮；无氮实验；甘蔗
The Detection of Activity for Endophytic Nitrogen Fixing Bacteria in Sugar-
cane (Saccharrum officinarum L.) by Stem Apical Culture Seedlings
WANG Lun-Wang1, LI Yang-Rui2,*, HE Wei-Zhong1, XIAN Wu1, LIANG Jun1, TAN Yu-Mo1
1Guangxi Sugarcane Research Institute, Nanning 530007, China; 2Crop Genetic Improvement and Biotechnology Laboratory,
Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China
Abstract: Sugarcane stem apical culture was conducted with introduced varieties ‘B1’, ‘B3’, ‘B5’, and ‘B8’
from Brazil and domestic varieties ‘GT11’ and ‘ROC16’ to investigate the effect of tissue culture on the
endophytic nitrogen fixation ability of the plants. The plants derived from stem apical culture that had been
cloned for 4 generations were treated with and without nitrogen. The other experiment was conducted by pot
culture without nitrogen fertilizer in the greenhouse. The results indicated that the regenerated plants of the
tested sugarcane varieties did not lose the biological nitrogen fixation ability after stem apical culture. Under
non-nitrogen condition, the nitrogen fixation capacity and growing vitality of the Brazilian varieties ‘B1’, ‘B3’,
‘B5’, and ‘B8’ were stronger than those of ‘GT11’ and ‘ROC16’, and the Brazilian varieties had stronger
growing capacity, higher nitrogen content and higher nitrogenase activity, and their symptom of nitrogen
deficiency appeared later. In the pot cultivation experiment, the Brazilian varieties showed more stalks, stronger
tillering and nitrogenase activity in leaves than ‘GT11’ and ‘ROC16’.
Key words: stem apical culture; biological nitrogen fixation; non-nitrogen experiment; sugarcane
收稿 2006-10-23 修定 2006-12-29
资助 国家自然科学基金(30260054 和 30660085)和国家农业
部“948”项目(200 3- Q 0 6)。
*通讯作者(E-mail：liyr@gxaas.net；Tel：0771-3247689)。
一般来说，甘蔗生产中氮肥投入比例较大。
就广西而言，每年甘蔗种植面积达 70 万公顷左
右，施用氮肥折合尿素约 42 万吨，投入的氮肥
成本高达人民币 8 亿元以上。如能减少氮肥施用
量，就能显著降低甘蔗生产成本。减少氮肥施用
量的较为经济有效办法是利用固氮生物的固氮特
性。巴西在这方面曾做过大量应用性研究
(Döbereiner 1988, 1992；Boddey 等 1991；
Döbereiner等1993；Reis等1994)，并取得有意义
的结果。Döbereiner (1988, 1992)、Döbereiner等
(1993)和Reis等(1994)的工作证实，与甘蔗有关的
固氮菌有3种：即固氮醋酸杆菌(Gluconacetobacter
diazotrophicus)、草螺菌(Herbaspirillum
s e r o p e d i c a e )和固氮螺菌(Az o s p i r i l l u m
halopraeferrans)。这些固氮细菌与豆科植物的根
瘤菌不同，属于植物内生固氮菌，在甘蔗的根、
茎、叶等器官组织中都能检测到，在离体茎段中
也能增殖传播。巴西已育成一大批有强固氮能力
的甘蔗品种，其中‘CB45-3’和‘SP70-1143’
尤为突出，这 2 个品种连续 3 年种在贫瘠的旱地
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上不施氮只施磷钾和微肥，每年甘蔗产量即可分
别达到244和 182 t·hm-1，每年固氮量分别达154
和134 kg (氮)·hm-1，固氮甘蔗品种通过固氮获得
其所需氮量的 60% 以上(Döbereiner 1992；
Döbereiner等1993)。近年来，谭裕模等(2002)从
巴西引进一批能固氮的甘蔗品种。他们用茎尖组
培苗和原种茎段检测方法证实其中的甘蔗品种
‘B 1 ’、‘B 3 ’、‘B 5 ’和‘B 8 ’具有很强
的固氮能力，在无氮盆栽的条件下，具有较高的
净光合速率，叶片叶绿素含量较高，ATP 酶活性
较高(梁俊等2005)。只需在苗期施少量的氮肥和
磷钾肥，甚至不施氮肥，能固氮的甘蔗品种
‘RB72-454’(‘B1’)产量可达到 123.7 t·hm-1 以
上，且无缺氮症状(谭裕模等2002)。区域品种比
较试验的结果表明，‘RB7 2 - 4 5 4’比对照品种
‘桂糖 11 号’增产 11.5%~51.4%，最高产量达
174 t·hm-1，增产显著(王伦旺等2002)。Xing 等
(2006)从‘B8’(‘RB86-7515’)的甘蔗茎段中分
离到一种新的内生固氮菌，并通过形态学、生理
生化及分子生物学鉴定其分类地位，命名为固氮
土壤杆菌(Agrobacterium diazotrophicus)。
本文采用组织培养方法，检测甘蔗茎尖组培
苗及由其长成的植株固氮活性变化，以期能为今
后采用茎尖组培苗方式检测从境内外引进的甘蔗品
种是否有固氮能力时提供参考。
材料与方法
材料有从巴西引进的具有内生固氮能力的甘
蔗(Saccharrum officinarum L.)品种‘B1’
(‘R B 7 2 - 4 5 4’)、‘B 3’(‘R B 8 3 - 5 0 8 9’)、
‘B 5’(‘N A 5 6 7 9’)和‘B 8’(‘R B 8 6 - 7 5 1 5’)
(Xing 等 2006；梁俊等2005；谭裕模等2002)以
及广西地区栽培的品种‘新台糖 1 6 号’
(‘R O C 1 6’)和‘桂糖 1 1 号’(‘G T 1 1’)。
采用茎尖分生组织培养，建立初代培养无性
系。试验于2003年11月~2004年1月参照贤武等
(2000)文中方法在广西甘蔗研究所组织培养实验室
进行。从甘蔗试验地分别取回各品种的中上部健
康成熟茎段，将其砍成单芽于52 ℃恒温水槽中浸
泡30 min后，再于38~40 ℃恒温条件下培植10~15
d，蔗芽萌发长至有 1~2 片叶时，切下蔗芽，去
掉老叶鞘和叶片，以 7 5 % 酒精消毒后，在温室
无菌条件下，用接种针和解剖刀小心剥离茎尖生
长点以外的幼叶(在解剖显微镜下进行)，切下长
约2 mm的茎尖分生组织，在无菌水中浸泡20~30
min后接种到茎尖诱导培养基(MS+2.0 mg·L-1 BA+
0.1 mg·L-1 NAA)上进行液体振动培养。诱导成丛
苗后，进行液体静置增殖培养。培养时光强为
30~40 µmol·m-2·s-1，照光时间10 h·d-1 左右，温
度为 27~30 ℃。
茎尖组培苗无氮培养试验于温室无菌条件
下，将不同品种的液体培养(MS+0.3 mg·L-1 6-BA)
继代4次的组培苗分别接种入改良的MS培养基(去
掉 MS 中所有含氮化合物，不附加任何生长调节
物质)中进行液体静置培养，以正常增殖的有氮培
养基(改良的MS+0.3 mg·L-1 6-BA)作对照并同时培
养。所有培养基均用双蒸馏水配制。每个品种的
有氮或无氮处理各 12 瓶，每瓶 8 苗。培养 15 d
后更换新的上述改良的 MS 培养基中，连续培养
30 d后，从每个处理中取6瓶分别用双蒸馏水反
复洗 4 次，再用滤纸吸干组培苗表面的水分后称
鲜重，由广西农业科学院土壤肥料研究所完成氮
素分析和干重测定。另外 6 瓶用岛津气相色谱仪
测乙炔还原(固氮)活性(因‘ROC16’增殖慢，材
料少，未作固氮活性测定)。
茎尖组培苗无氮栽培试验于2004年4月10日
在温室条件下进行，各品种的茎尖组培苗经生根
培养(MS+10 mg·L-1 NAA)后移植到无菌、低氮、
新红壤基质(经121 ℃高压灭菌60 min，土壤全氮
含量为 0.033%，水解氮为 22 mg·kg-1)中进行盆
栽，每盆装干土 20 kg，种植 1 株健壮组培苗，
每品种种3盆，在整个培养过程中每盆只施用25 g
KH2PO4 (分 2 次淋施，浓度 2%)，不施氮素肥料，
2004年11月20~26日观察蔗株生长情况和按上述
方法测定各品种叶片的固氮活性。
实验结果
1 无氮培养条件下不同品种甘蔗组培苗的生长
在不附加任何生长调节物质和氮素条件下培
养 15 d 的各品种组培苗长势弱，叶色淡，出现
黄叶，生根，增殖减缓，与正常有氮培养相比
品种之间有明显差异，‘R O C 1 6 ’和‘G T 1 1 ’
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的组培苗黄化速度最快，长势最弱，增殖缓慢，
不生根；‘B 1’和‘B 3’的组培苗黄化速度最
慢，缺氮症状出现时间最迟，生根少；‘B 5 ’
和‘B8’黄化速度和缺氮症状出现时间居中，但
生 根 多 。 组 培 苗 黄 叶 数 从 多 到 少 依 次 为
‘R O C 1 6 ’>‘G T 1 1 ’>‘B 8 ’>‘B 5 ’>‘B 3 ’>
‘B1’(表 1)。说明各品种之间耐氮缺失的能力差
异较大，可能与品种间的固氮活性大小有关。
表1 无氮培养条件下不同品种甘蔗组培苗的生长
Table 1 The growth of regenerated plants of different varieties under non-nitrogen condition
品种 增值芽数/个·瓶-1 生根数/条·瓶-1 枯黄叶数/片·瓶-1 生长情况
‘B 1 ’ 12.7Aa 1.7Bbc 1.0Ec 叶色绿色，长势较好，无明显缺氮症状。
‘B 3 ’ 10.0ABab 3.6Bb 2.2DEc 叶色绿色，长势好，无明显缺氮症状。
‘B 5 ’ 8.0ABCab 9.4Aa 5.2CDb 叶色淡，长势弱，显现缺氮症状。
‘B 8 ’ 9.7ABCab 8.7Aa 6.8BCb 叶色淡，长势较好，显现缺氮症状。
‘G T 1 1 ’ 5.2BCbc 0Bc 9.3ABa 部分苗枯死；叶色淡，长势弱，缺氮症状较明显。
‘R O C 1 6 ’ 3.0Cc 0Bc 10.0Aa 部分苗枯死；叶色淡，长势弱，缺氮症状极明显。
培养 15 d 后测定。表中各列中不同大写字母表示差异极显著，不同小写字母表示差异显著，下表同此。
2 无氮和有氮培养条件下不同品种甘蔗组培苗的
含氮量、干重和固氮活性
从表2可以看出，茎尖组培苗无氮培养30 d
后，4 个巴西甘蔗品种的氮含量都比‘GT11’和
‘R O C 1 6 ’的高，从高到低依次是‘B 8 ’>
‘B 5 ’>‘B 3 ’>‘B 1 ’>‘G T 1 1 ’>
‘R O C 1 6’，各甘蔗品种的氮含量都比有氮培养
的低；干物质重量变化因品种而异，无氮培养30
d 后的干重高于有氮培养的品种只有‘B8’，其
他品种则相反。但从固氮活性来看，无氮培养的
各甘蔗品种的固氮活性明显高于有氮培养的，巴
西品种明显高于广西地区栽培品种‘GT11’；其
中‘B8’经无氮培养 30 d 后的固氮活性最高，
达到46.236 nmol (C2H4)·g-1 (FW)·h-1，是‘GT11’
的 5 7 倍，但‘B 8 ’也显现出缺氮症状。上述
结果说明，即使是具有内生固氮菌并有固氮能力
的巴西甘蔗品种在组培的条件下，培养基中也不
能缺少氮素，否则生长不良，或黄化枯死。这
说明甘蔗幼苗生长初期的形态建成和体内固氮酶合
成时均还需要供应一定的无机氮素。同时这也可
能是为什么在生产中甘蔗苗期必须施用一定量氮肥
的原因。
3 不同品种甘蔗茎尖组培苗耐无氮栽培能力比较
不同品种甘蔗茎尖组培苗生根后移入温室中
盆栽，土壤经过高压灭菌。栽培时如不施氮肥，
植株叶色即变淡，生长明显减缓，茎变细，分
表2 无氮和有氮培养条件下甘蔗组培苗的含氮量、干重和固氮活性
Table 2 The content of nitrogen and the weight of dry matter and the nitrogenase activity of the regenerated plants
under non-nitrogen or nitrogen condition
品种
无氮培养 有氮培养
含氮量/% 干重/g·瓶-1
固氮活性/ 含氮量/% 干重/g·瓶-1
固氮活性/
nmol (C2H4)·g-1 (FW)·h-1 nmol (C2H4)·g-1 (FW)·h-1
‘B 1 ’ 1.327ABab 2.26ABab 4.459Bbc 3.952Aa 2.73BCb 4.214Aa
‘B 3 ’ 1.387ABab 2.60Aa 9.873Bb 3.429Aa 3.49Aa 0.286Bbc
‘B 5 ’ 1.662ABa 2.16ABabc 12.383Bb 3.654Aa 3.22ABa 0.721Bbc
‘B 8 ’ 1.781Aa 1.91ABCbc 46.236Aa 4.404Aa 1.74Dd 1.547Bb
‘G T 1 1 ’ 1.123Bb 1.69BCcd 0.810Bc 4.515Aa 2.66BCbc 0.06Bc
‘R O C 1 6 ’ 1.066Bb 1.26Cd — 3.376Aa 2.26CDc —
培养 30 d 后测定。
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蘖少，呈现出明显的缺氮症状。各品种缺氮症状
出现的时间顺序与无氮培养的组培苗相似，其中
有 4 个巴西品种甘蔗明显晚些。种植 7 个月后各
品种的株高仅30~83 cm，茎径仅1.68~2.02 cm，
每株分蘖0.7~2.3个，叶片固氮活性2.146~8.006
nmol (C2H4)·g-1 (FW)·h-1。其中 4个巴西甘蔗品种
的株高和分蘖数均超过广西地区品种‘ROC1 6’
和‘G T 1 1 ’。不同品种之间的叶片固氮活性变
化与株高变化相似，固氮活性从高到低依次为
‘B 8 ’>‘B 5 ’>‘B 3 ’>‘B 1 ’>‘G T 1 1 ’>
‘ROC16’(表 3)，显示固氮活性越高的品种，栽
培时耐无氮的能力越强。
固氮醋酸杆菌专用培养基(1.5%的琼脂)上呈现橙
色反应(谭裕模等 2002)，甘蔗品种‘GT11’的
则保持蓝色，据此推测甘蔗品种‘B 1’茎尖培
养长成植株后，其体内仍然有具固氮活性的内生
固氮菌存在，但对此尚需进一步研究。
( 2 ) 引进的巴西甘蔗品种‘B 8 ’、‘B 5 ’、
‘B 3’和‘B 1’的固氮能力强于广西地区栽培
的品种‘新台糖 16 号’(‘ROC16’)和‘桂糖 11
号’(‘GT11’)。这与已有报道(谭裕模等 2002；
梁俊等2005)是一致的。但如不补充外源氮素，有
固氮能力的甘蔗品种幼苗生长也不正常，并出现
缺氮症状。因此生产中根据甘蔗品种的特性适时
合理施用氮肥是必要的。
参考文献
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表3 各品种组培苗无氮栽培条件下主要农艺性状及其叶
片的固氮酶活性
Table 3 The tested varieties’ agronomic performance and
nitrogenase activity under free nitrogen fertilizer-used
cultivation condition
品种
固氮活性/
株高/cm
分蘖数/
茎径/ nmol (C2H4)·
条·株-1
cm g-1(FW)·h-1
‘B 1 ’ 3.493BCbc 60ABbc 2.0ABa 2.01Aa
‘B 3 ’ 6.064ABab 75ABab 1.3ABab 1.89Aa
‘B 5 ’ 7.604Aa 78ABab 2.3Aa 1.78Aa
‘B 8 ’ 8.006Aa 83Aa 1.7ABab 1.96Aa
‘G T 1 1 ’ 2.725BCc 53BCc 0.7Bb 2.02Aa
‘R O C 1 6 ’ 2.146Cc 30Cd 0.7Bb 1.68Aa
讨 论
根据本试验结果可以得出 2 个印象。
(1)茎尖培养长成的甘蔗再生植株，其体内的
内生固氮菌的固氮能力不会丧失。说明根据茎尖
组培苗的表现，判别和决定能否引种具有固氮能
力的甘蔗品种是可行的。我们曾对甘蔗品种
‘B1’和‘GT11’的茎尖培养物(包括组培苗和
培养液) 进行显微检测，未见到有宿根矮化病
(RSD)的病原菌， PCR 检测其反应为阴性，因此
可以认为茎尖培养的 RSD 等病原菌已消失，可以
除病脱毒(邓展云等2004)。但甘蔗品种‘B1’茎
尖组培苗的假茎段在含有溴百里香草酚蓝的 LGI