全 文 ：基金项目:南阳师范学院资助项目(nytc2004k10)南阳市科技攻关项目(2005PTO64)
作者简介:王正德(1963-),男 ,河南邓州人 ,南阳师范学院生物系讲师 ,本科 ,主要从事应用生物技术研究工作。
　　收稿日期:2006-07-11
欧李茎尖培养脱毒研究
王正德　庞发虎
(南阳师范学院生物系,河南南阳　 473000)
摘　要:以欧李嫩梢芽为外植体进行了微茎尖组培脱毒研究 , 探讨了在培养基中添加不同的激素成分及不同浓度对
不定芽诱导 、继代增殖和生根培养的影响。结果表明不定芽诱导的最佳培养基是:MS+6 -BA0.4mg/l+IAA0.5mg/
L;增殖培养的最适培养基为 MS+6-BA0.3 mg/L+IAA0.4mg/L;最佳生根培养基是:2/3MS+IAA0.5 mg/L。应用
指示植物鉴定法进行病毒检测显示 , 0.3-0.4mm茎尖培养对苹果褪绿斑病毒(ACLSV)和李矮缩病毒(PDV)的脱毒
率为 71.6%和 73% ,实验证明是一种可靠实用的方法。
关键词:欧李;茎尖培养;脱毒;快速繁殖
中图分类号　S601　　　文献标识码　A　　　文章编号　1007-7731(2006)07-42-02
Invitroshoottiptissuevirus-freecultureofPrunushumilis
WANGZhengde　PANGFahu　(BiologicalDepartmentofNanyangNormalColege, NanyangHenan, 473000)
Abstract:BudsortenderstemofPrunushumilisasexplant, themicropropagationandtheinfluenceofthefactorssuchas
diferenthormonecomposition, concentrationinculturemediumuponadventitiousbudinduction, shootproliferationandroo-
tingwerestudied.TheresultshowsthattheoptimummediumforadventitiousbudregenerationisMS+6-BA0.4 mg/L+
IAA0.5 mg/L;thebestculturemediumforshootproliferationisMS+6-BA0.3mg/L+IAA0.4 mg/L;theproperculture
mediumofrootingis2/3MS+IAA0.5mg/L.Thevirus-freerateofACLSVandPDVwere71.6% and73% respectivelyon
0.3-0.4mmshoottipbasedontheplantindicatoridentification, whichisareliableandadaptmethod.
Keywords:Prunushumilis;shoottipculture;virus-free;rapidreproduction
　　欧李(PrunushumilisBunge.)属蔷薇科李亚科李属
(Prunus),落叶小灌木 ,原产中国 ,东北 、华北及附近 13个
省 、市 、区均有分布 [ 2, 3, 4] 。欧李早春开花 ,白色至淡红色 ,
状似樱花;整株株型优美 ,可作观赏植物 。其果实营养丰
富 ,酸甜可食 ,含有人体所必需的多种营养物质和微量元
素 ,近年来发现其钙和铁的含量属于所有水果之冠 ,据测
定每 100g果肉含钙 360mg,铁 58mg[ 1-3] ,被人们称为 “钙
果 ”[ 4] ,是天然的补钙 、补铁佳品。欧李果仁入药为 “郁李
仁 ”。欧李抗旱耐寒 、耐瘠薄 ,根系发达 ,生长迅速 ,是水土
保持 、退耕还林的优势植物 [ 3] 。综上 ,欧李属赏 、食 、药 、生
态多用途优良树种 ,因此市场苗木需求量日益增大。但在
生产中 ,通常的分株繁殖和扦插繁殖系数都很低 ,不能满
足商业化大量生产的要求 。阎贤伟 [ 6]等试图用不同的组
织培养方法快繁 ,目前已获部分成功。由于欧李长期处于
野生状态 ,根据李属植物带毒情况 [ 7-8]和作者长期对室外
欧李苗木表征的观察认为至少存在苹果褪绿叶斑病毒
(ACLSV)和李矮缩病毒(PDV)的危害。
上述的无性繁殖方法常会携带母株的病毒 ,影响其生
长和果实产量 、质量;无毒苗的组织培养未见报道。一般
认为活跃的分生组织是病毒尚未到达的部位 [ 9-10] ,作者再
前期茎段培养的基础上采用微茎尖培养的方法 ,对获得欧
李无病毒植株的途径进行了研究和探讨。
1　材料与方法
1.1　材料　03年秋选取生长正常初步表现带病毒症
状的(用指示植物方法确认见 1.6)一年生分株繁殖苗
待用(盆栽),株高 0.5m左右。由南阳阳光花木公司提
供 。
1.2　培养基配方　以 MS为基本培养基加蔗糖 30g/L、琼
脂(前期)7g/L
琼脂(生根)5.5g/L固体培养 激素单位为 mg/L
茎尖成活培养基 MS+6-BA0.5+IAA0.3
茎尖分生组织启动培养基
(1)MS+6 -BA0.7 (2)MS+6 -BA0.4 +IAA0.5
(3)MS+6 -BA0.4 +IAA0.3
继代培养基
(1)MS+6 -BA0.5 (2)MS+6 -BA0.3 +IAA0.4
(3)MS+6 -BA0.3 +IAA0.2
生根培养基
(1)2/3MS+IAA0.7 (2)2/3MS+IAA0.5 (3)2/3MS
+IAA0.3
1.3　茎尖处理　 ①选取长势好枝端长约 1.5cm幼茎 ,剪
去肉眼可见叶片 ,置烧杯中加入少许洗衣粉 ,以缓流自来
水冲洗 25min;在超净工作台上以 75%酒精浸泡 35s,后用
0.1%升汞(加 2滴吐温)浸泡约 3min,无菌水冲洗 3 -5
42 安徽农学通报 , AnhuiAgri.Sci.Bul.2006, 12(7):42-43
DOI :10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2006.07.022
遍 ,至不再有泡沫泛起 ,取出置无菌纸上吸干表面水分 。
②超净工作台上切取前期幼茎培养的试管增殖苗
1cm左右幼芽 。
1.4　茎尖剥离和培养　在超净工作台上解剖镜下用解剖
针剥除顶芽及部分已展开的叶原基 ,切取 0.3-0.4mm,带
1-2个叶原基的分生组织 ,迅速接种在成活培养基上培
养 。
1.5　培养条件　温度 25±2℃ PH为 5.8前期光照 1500
-2000Lx13h/d生根光照调至 2500-3000Lx8-10h/d。
1.6　病毒检测　采用指示植物黄瓜和桃(GF305)的实生
苗对初代组培苗进行病毒检测 。方法:在温室内用灭菌细
昆虫针轻刺指示植物初展叶(2-3片)挤滤出初代培养的
脱毒待检苗幼茎叶的汁液 ,沾接在针刺部位。用无菌水和
待检叶汁液处理作对比 ,试验重复三次 ,于接种后第 3 -4
周 ,每天观察叶有无褪绿斑 ,枯斑和坏死的斑点产生及产
生的数量和叶有无畸形。只要两种指示植物检测有 1种
症状即以剔出其继代培养体系的试管苗。
实验表明:黄瓜接种 10d左右 , PDV症状表现为黄绿
色褪绿斑或花叶 , A-CLSV表现为个别植株缩短花斑;有
些是开始出现叶脉褪绿 ,逐渐发展成为系统花叶 。桃叶对
ACLSV反应为暗绿色凹陷斑 , PDV表现为褪绿斑驳畸形
叶 ,节间短 ,但时间延后。检测结果表明:0.3 -0.4mm茎
尖培养对苹果褪绿斑病毒(ACLSV)和李矮缩病毒(PDV)
的脱毒率为 71.6%和 73%。
1.7　脱毒试管苗获得
经上述方法检测确信无病毒的继代培养苗继续增殖
培养。
1.8　试管苗的练苗 、移栽　在温室内逐步打开已生根的
培养瓶盖 、练苗 7d左右移出试管苗 ,洗掉根际培养基 ,移
栽到经 0.3%硫酸铜溶液消毒的通透良好的培养土中培
养 ,保持温度 20-25℃,湿度 80%左右 ,一周后逐渐降低
湿度和提高光强 ,一个月后带土团移栽 ,深度以原培养土
迹低于表土 1cm为宜。成活率达 81%。
2　结果与分析
实验结果如表 1。
表 1　不同外植体成活率分析
外植体 接入数(块)
污染率
(%)
褐化率
(%)
成活数
(株)
成活率
(%)
栽培株茎尖分生组织 50 8 0 33 67
试管苗茎尖分生组织 50 0 0 12 27
　　(1)据观察 ,欧李茎尖组织培养未见外植体褐化现
象 ,有利于及时排出污染。
(2)培养 5d组织即开始膨大逐渐形成愈伤组织 , 20d
左右确认成活后接入初代培养基培养 。
(3)茎尖成活培养中总成活率偏低 ,采用春季自然生
长的茎尖接种 ,成活率显著高于试管苗茎尖 ,且后期苗健
壮 。
通过外观筛选和指示植物测试 ,取自栽培和取自试管
的茎尖分生组织脱毒率没有显著差别 ,因此后期增殖培养
采用栽培苗茎尖培养体系。
表 2　激素配合对启动不定芽萌发的影响分析
激素组合 芽始萌动(d)
萌发率
(%) 芽长势
6-BA0.7 8 61 腋芽长势不整齐有部分黄苗
6-BA0.4+IAA0.5 5 86 腋芽较粗状 ,色绿光泽好
6-BA0.4+IAA0.3 7 73 长势较好
　　(4)初代培养 5d后出现绿色芽点 ,接着长出幼芽 , 25d
后丛芽长至 3-5cm, 由表 2分析可知初代培养最适激素
浓度为 6-BA0.4+IAA0.5
表 3　激素配合对增殖培养的影响分析
激素组合 10d后(芽 /株) 25d后(芽 /株) 芽长势
6-BA0.5 0.62 3.1 长势较好
6-BA0.3+IAA0.4 0.92 4.6 长势壮色绿
6-BA0.3+IAA0.2 0.65 3.7 长势不齐色淡
　　(5)切取初代培养幼茎 1.5cm左右侧芽转接至继代
培养基进行继代培养 , 4d后新侧芽萌动 , 6d后开始生长 ,
25d后新枝长至 2-3cm.由表 3分析知继代增殖较好的
激素组合为 6-BA0.3+IAA0.4
表 4　激素浓度对生根率的影响分析
激素组合 15d平均根数(条)
30d后平均根数
(条)
35d总生根率
(%) 根长势
IAA0.7 0.8 2 34 粗
IAA0.5 1.5 4 72 长且粗壮
IAA0.3 0.7 2.1 35 长
　　(6)生根培养 选取健壮的芽切成 1.5cm左右的茎段 ,
接入生根培养基 , 7d后根尖萌动 , 15d后生长迅速。同一
培养基中 ,壮芽生根量显著高于弱芽 ,由表 4分析可知较
好的生根激素浓度是 IAA0.5,在此浓度下 ,植株根系较粗
壮且部分有侧根 。
3　讨论
(1)上述各培养基配方是在前期研究的基础上经过
筛选后确定的 。
(2)由于脱毒所需茎尖外植体小而脆弱 ,采自前期试
管苗茎尖分生组织成活率低可能是芽内营养水平低 ,生理
状况弱于栽培苗茎尖 ,因而其成活率显著低于栽培苗茎尖
分生组织。
(3)观察表明影响欧李试管苗生根的主要原因是苗
细弱 ,这可能与欧李试管苗在继代培养中分化系数高 、大
量丛生芽竞争体内有机物和培养基养分所致 ,目前这一方
面研究仍在进行和探讨之中 。
(4)适当降低生根阶段培养基的琼脂用量 ,即降低培
养基的固相程度 ,可使生根提前并提高生根率 ,使后期洗
根更容易 ,也不易伤根 ,提高成活率 。本研究表明较适宜
的琼脂用量是 5.5g/L,既不影响整体培养过程又使生根
更容易 。
(5)此研究脱毒检测时仅用了表观诊断和指示植物
检测 ,但通过一年多对移栽苗观测证明 ,两种植物监测结
果趋向一致 ,认为效果可靠 ,此检测方法简便易行 、成本
低 ,是基层单位适用的方法 。脱毒苗与未 (下转 46页)
43
抑制光呼吸方面起一定作用 ,从而导致其对光抑制较为敏
感 。玉米酶这些负面影响可能暗示 C3植物 MCs内碳代
谢具显著灵活性 ,尤其在细胞质和叶绿体基质之间的代谢
物质运输方面 。
通过 PPDK增加种子产量的机制目前还不清楚 ,一种
可能是在叶绿体中超表达的 PPDK使包围种子器官的光
合有所增加。在 C3 双子叶植物和单子叶植物的小穗中 ,
与 C4途径相关的酶活性很高且有类 C4光合在运转 ,这对
种子的充实具有一定的贡献 。因此 ,在叶绿体中 PPDK的
超表达能提高象豆荚和穗部器官的类 C4光合来增加种子
和谷粒的产量 。
转基因植物的实验证实了 C4机制是具有精细调控的
复杂过程 ,缺乏 C4植物集中进化的 Kranz叶结构的情况
下 , C3植物能否产生一个有效的 CO2 浓缩机制 ? 没有一
个有效的 CO2扩散屏障而建立的 CO2浓缩机制代谢代价
是否超出它的有利方面。近年发现水生巨型植物(Magnin
etal., 1997;Casatietal., 2000)(SAMs)像 HydrilaVerti-
cilata没有 Kranz结构但其具有高等植物的 CO2浓缩机
制 ,这种胞间类 C4途径在周围 CO2浓度下降的情况下被
诱导。然而 ,仍然需要明确这一进程在 SAM种除 C3进程
外是高效的还是低效的生存机制。SAM植物类 C4途径诱
导机制的研究有助于我们理解把有效的类 C4机制导入
C3植物 MCs。随着生物技术的发展 ,加强学科之间联系 ,
可以扫除 C4光合途径基因工程的障碍。令人激动的是源
于玉米的 C4 基因已被成功克隆并正在导入超级杂交稻
的亲本 。理论上 C4基因的光合效率比水稻的 C3基因高
30%。国家杂交水稻工程技术研究中心课题组提出了第
三阶段超级杂交稻育种计划 ,即到 2010年 ,水稻单产可在
现有超级杂交稻的基础上再提高 100kg,达到大面积单产
13500kg/hm2 。
参考文献
[ 1] BlackCC..PhotosyntheticcarbonfixationinrelationtonetCO2 up-
take.Annu.Rev.Plant.Physiol., 1973, 24:253-286
[ 2] BrownRH, BassetCL, CameronRG, etal.PhotosynthesisofF1
hybridsbetweenC4 andC3 -C4 species.PlantPhysiol., 1986, 82:
211-217
[ 3] KuMSB, KanoMurakamiY, MatsuokaM.Evolutionandexpres-
sionofC4 photosynthesisgenes.PlantPhysiol, 1996, 111 :949-
957
[ 4] AoyakiK, BasshamJA.AppearanceandaccumulationofC4 carbon
pathwayenzymesindevelopingwheatleaves.PlantPhysiol., 1986,
80:334-340
[ 5] HatchMD.C4 photosynthesis:auniqueblendofmodifiedbiochem-
istry, anatomyandultrastructure[ J] , Biochim.Biophys.Acta,
1987, 895:81-106
[ 6] RikisiK, OquroH, SamejimaM, etal.C4 -likeplantsderived
fromacrossAtriplexrosea(C4)ⅸAtriplexputula(C3)ⅸAtriplex
rosea(C4).JapanJBreed, 1998, 38:397-408
[ 7] MauriceSBKu, SakaeAgarie, MikaNomura, etal.Highlevelex-
pressionofmaizephosphoenolpyruvatecarboxylaseintransgenicrice
plants.NatureBiotechnology, 1999, 17:76-80
[ 8] MatsuokaM , FukayamaH, TsuchidaH, etal.Howtoexpress
someC4 photosynthesisgenesathighlevelsinrice.In:SheehyJ
E, MitchelPL, HardyB(eds).RedesigningRicePhotosyn-
thesistoIncreaseYield.Philipa:ElsevierScience, 2000, 167
-175
[ 9]张方 , 迟伟, 金成哲等.高粱 C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基
因的分子克隆及其转基因水稻的培育 .科学通报 , 2003, 48:
1542-1546
[ 10] 陈绪清 , 张晓东 , 梁荣奇 .玉米 C4型 pepc基因的分子克隆及
其在小麦的转基因研究.科学通报 , 2004, 49:1976-1982
[ 11] HedspethRL, GrulaWJ, DaiZ, etal.Expressionofmaizephos-
phoenopyruvatecarboxylaseintransgenictobacco.PlantPhysio1,
1992, 98:458-464
[ 12] GehlenJ, PanstrugaR, SmetsH, etal.Efectsofalteredphos-
phoenolpyruvatecarboxylaseactivitiesontransgenicC3 plantSolanum
tuberosum.PlantMolBiol, 1996, 32, 831-848
[ 13]焦德茂等.转 PEPC基因水稻的光合 CO2同化和叶绿素荧光特
性.科学通报 , 2001 , 46(5):414-418
[ 14] SherifA, MeyerH, RiedelE, etal.Theinfluenceofplantpyruvate
, orthophosphatedikinaseonaC
4
plantwithrespecttotheintracelu-
larlocationoftheenzyme.PlantScience, l998, l36(1):43-57
[ 15 ] HiroshiF.SignificantAccumulationofC4 -SpecificinaC3 Plant.
RicePlantPhysiology, 2001, 127, 1136-1146
[ 16] ChiW, ZhouJS, etal.PhotosyntheticFeaturesofTransgenicRice
ExpressingSorghumC4 TypeNADP-MEActaBotanicaSinica,
2004, 46(7):873-882
(上接 43页)脱毒苗相比较 ,还苗快 ,营养生长旺盛 ,开花
多而整齐 ,但结果量和果实品质提高情况还有待今后进一
步研究 。
参考文献
[ 1]曹贵荣 ,欧李(钙果)主要性状及开发利用 ,山西果树 [ J] , 2002,
03(2):55-56
[ 2]杜俊杰 、杨怀义 、曹琴 , 欧李选种研究 , 中国农史 [ J] , 1998,第 4
期:78-79
[ 3]刘十通 ,红钙果栽培技术与应用前景 , 中国种业 [ J] 。 2004, 11
(2):67-68
[ 4]唐宸 ,天然补钙水果———钙果 ,中国林业 [ J] , 2003,第 2期:45-
46
[ 5]钟士传 、王侠礼 ,钙果微体快繁技术研究 ,中国林业 [ J] , 1997.第
2期:87-89
[ 6]阎传伟 ,植物组织培养简报摘编, 植物生理通讯 [ J] , 1988, 第 4
期:40
[ 7] 洪建国 ,国外果树病毒和无病毒果树培育 ,世界农业 [ J] 1990
(4):46-47
[ 8]王国平 、洪霓 ,我国果树病毒发生危害现状与放治对策 , 北方果
树 [ J] , 1997(1):8-10
[ 9]雷增普 、赵增仁 , 果树和葡萄的病毒病及类菌质体病害 [ M]北
京:中国林业出版社 , 1991
[ 10]郑金成 ,苹果树无毒苗木繁育技术 [ M] ,北京:中国农业出版
社 , 1995
46