全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 529
薯蓣中内源激素的提取及高效液相色谱测定法
胡建斌 *，李建吾，孙守如
河南农业大学林学园艺学院，郑州 450002
Extraction and High Performance Liquid Chromatographic Determination
of Endogenous Hormones in Dioscorea zingiberensis C. H. Wright
HU Jian-Bin*, LI Jian-Wu, SUN Shou-Ru
College of Forestry and Horticulture, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
提要：以薯蓣的叶片、茎、块茎和根为材料，探讨了4种内源激素的提取和纯化方法以及适宜于高效液相色谱(HPLC)联
合测试的色谱条件。方法的线性关系良好，回收率高，试验稳定性好。
关键词：薯蓣；内源激素；高效液相色谱；测定
收稿 2007-03-19 修定 2007-05-22
资助 河南省科技攻关重点项目(0 123 011 000 )。
* E - m a i l：j b h u 2 2 0 @ y a h o o . c o m . c n；T e l：0 3 7 1 -
63554959
一些植物内源激素或生长调节物质，如吲哚
乙酸(IAA)、赤霉酸(GA3)、脱落酸(ABA)和茉莉
酸( J A )在大蒜( R a v n i k a r 等 1 9 9 3 )、马铃薯
(Marschner等 1984；马崇坚等 2003)、地黄(薛
建平等 2004)、甘薯(Naktani和 Komeichi 1991；
王庆美等2005)等植物的贮藏器官形成过程中有调
节作用。研究植物内源激素或生长调节物质含量
的变化规律不仅可以加深对植物器官变态机制的认
识，还有望以通过施加外源激素或生长调节物质
的手段调控贮藏器官发育过程，为提高这类作物
的产量提供技术支持。但植物体内激素和生长调
节物质种类多、含量甚微，且易被破坏，因此，
寻求灵敏、专一而又简单易行的测定方法是研究
植物内源激素和生长调节物质的前提。植物内源
激素的测定方法有生物学鉴定法(丁静等 1979)、
气相色谱法(杜黎明和许庆琴 2000)、酶联免疫法
(吴颂如等 1988)和高效液相色谱法(HPLC) (谈锋
1986；李金永等 1994)等。相对而言，HPLC法
有灵敏度高、专一性强和重复性好等优点，但对
样品纯度要求甚高，需要有适宜的提取和纯化内
源激素或生长调节物质的方法。罗正荣(1990)认
为，不同植物材料甚至同一植物不同组织的组分
差异较大，用同一方法难以满足提取和纯化不同
组分组织中内源激素或生长调节物质的要求，所
以迄今对此尚无一个理想的方法。
薯蓣为薯蓣科薯蓣属多年生草质藤本植物，
有地下块茎，由于组织中富含多糖、多酚、色
素、甙类等多种成分，分析其内源激素或生长调
节物质含量较为困难(李鹄鸣和张晓蓉 1999)。因
此，目前有关薯蓣属植物的内源激素或生长调节
物质的研究报道甚少。为此，本文对薯蓣的 4种
内源激素或生长调节物质，即 IAA、GA3、ABA
和 JA的提取、纯化以及 HPLC检测方法作了探
讨，同时也为测定其他具有贮藏器官的植物中内
源激素时提供参考。
材料与方法
1 材料
材料为一年生薯蓣(Dioscorea zingiberensis C.
H. Wright)的叶片、茎、块茎和根。采集新鲜样
品后迅速投入液氮中固定，于 -20 ℃保存备用。
2 仪器与试剂
试验采用Waters公司2010型高效液相色谱系
统，包括 510型双泵，717型自动进样器，2487
型紫外检测器，2010色谱工作站。内源激素提取
装置包括减压旋转浓缩仪、高速离心机和 pH计
等。激素标样品 IAA、GA3及ABA购于 Sigma公
司，JA购于 Fluka Chemie AG公司。
3 内源激素的提取与纯化
准确取1 g冻存样品，加入20 mL预冷的80%
甲醇溶液，低温中研磨匀浆后，于 4 ℃下搅拌 12
h，以 7 200×g离心 15 min，沉淀再用 80%甲醇
植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月530
提取 2次(20 mL，2 h；10 mL，1 h)。合并上
清液，于 40 ℃下旋转减压蒸至水相，用 0.4 mol·L-1
Na2HPO4调整 pH至 8.0。水相除杂采取 3种方案：
(1)等体积石油醚萃取 3次；(2) 2倍体积石油醚萃
取 3次；(3)等体积石油醚和乙酸乙酯混合液(1:1，
V/V)萃取 3次。旋转减压蒸去残存酯相，加 0.4
g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Sigma)并于 4 ℃下搅拌
30 min，以 7 200×g离心 10 min，弃去 PVP，以
0.4 mol·L-1柠檬酸调 pH值至 3.0，用等体积乙酸乙
酯萃取 3次。合并酯相并于 40 ℃下减压蒸干，用
1 mL 95%乙醇溶解残留物，以 0.45 µm微孔滤膜
过滤后，作试液用。
4 色谱条件
标样液经 200~300 nm全波长扫描，取 210
nm显示检测，灵敏度 0~0.5 AUFS。色谱柱为
Nova-pak C18柱(Waters 3.9 mm ID×150 mm，10
µm P.S.)，柱温 35 ℃。在已确定的适宜检测波
长下，比较甲醇:2%乙酸:水(40:40:20，V/V)、色
谱纯甲醇与 0.05 mol·L-1 pH 7.0的磷酸缓冲液(40:
60，V/V)、15%-30%-15% 色谱纯甲醇与 0.05
mol·L-1 pH 7.0的磷酸缓冲液 3种流动相洗脱效果，
流速 0.8 mL·min-1，进样量为 10 µL。样品内源
激素含量用内标法定性，外标法进行峰面积定
量，绘制浓度与峰面积的标准曲线 ( 马崇坚
2003)。
实验结果
1 萃取剂的选择
采取 3种方案对样品进行脱色处理的结果表
明，常规的石油醚萃取法中的方案(1)和(2)的两相
分层速度慢，萃取时间过长(萃取一次大约需 30
mi n)，两相界面模糊不清，且脱色不彻底；而
方案(3)的分层速度快，数分钟内两相明显分层，
且水相基本上呈无色和透明状，脱色效果和工作
效率提高。因此认为用石油醚和乙酸乙酯混合萃
取法，即方案(3)更适合于薯蓣组织中内源激素或
生长调节物质的净化。
2 流动相的选择
以 3种流动相分别对含有 IAA、GA3、ABA
和 JA 4种标样溶液进行洗脱和测试的结果显示，
甲醇:2%乙酸:水和等浓度的甲醇和磷酸缓冲液2种
流动相虽然测试时间较短，但均难以将 GA3和
ABA完全分离。从HPLC图谱来看，GA3和ABA
波峰明显受到干扰。而甲醇和磷酸缓冲液混合梯
度洗脱虽时间稍长，但 4种激素的标样品均达到
满意的分离效果(图 1)。
4 线性关系的测验
4种标样品分别配制成已知系列浓度的溶液
并进行HPLC测定，绘制波峰面积与之对应的标
样浓度之间的函数关系，即 4种内源激素或生长
图 1 4种标样以色谱纯甲醇和磷酸缓冲液(0.05 mol·L-1，
pH 7.0)为流动相混合梯度洗脱时的图谱
3 C18柱的样品分离图谱
薯蓣样品中内源激素的分离和测定采用最佳
的提纯方法和色谱条件，提取液以C18柱分离的色
谱图见图 2。在相应的保留时间，4 种内源激素
均出现清晰的波峰，所有波峰均未出现不良峰型
和拖尾现象，说明本法的除杂效果较好，样品中
4 种内源激素得到了良好的分离。这些结果表
明，试验中所用的分离纯化方法和HPLC色谱条
件均可满足HPLC分析测定薯蓣组织中内源激素或
生长调节物质的要求。
图 2 薯蓣样品以色谱纯甲醇和磷酸缓冲液(0.05 mol·L-1，
pH 7.0)为流动相混合梯度洗脱时的图谱
植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 531
调节物质的标准曲线。不同激素的标准曲线方程
分别为：YIAA=8.18704E-6X+0.01059 (r=0.9995) ；
YGA3=2.94418E- 5X+0.04696 (r=0.9947) ；YABA=
3.66746E-5X+0.02276 (r=0.9889) ；YJA=5.06107E-
4X- 0.14395 (r=0.9892)。其中，Y为标样浓度
(µg·mL-1)，X为色谱图上标样所对应的峰面积。
5 回收率
采用加样回收法测定本法的回收率(王若仲等
2002)。将薯蓣样品等量分成 2份，其中一份加
入已知量的 IAA、GA3、ABA和 JA标样品，另
一份不加以计算本底值。2份样品分别按前述方
法中步骤平行操作，重复 5 次。测定结果表明，
4种内源激素或生长调节物质的平均回收率分别为
93.6%、88.4%、91.3%和 92.5%。相对标准偏
差(RSD)分别为 3.4%、6.2%、4.7%和 6.8%。说
明本法的回收率符合定量分析要求，且数据误差
小，因而可以认为上述的提取和纯化方法以及
HPLC色谱条件是可行的。
6 方法的应用
用上述提取、纯化和测定方法，测定薯蓣块
茎膨大期的叶片、茎、块茎和根中的内源 IAA、
GA3、ABA和 JA的结果见表 1。同时，用本文
中方法测定薯蓣种子和气生块茎的内源激素也较为
理想，说明此法适合于薯蓣各种器官和部位中内
源激素或生长调节物质含量的测定。
的组分复杂，且组分性质各异，因而分析测试其
内源激素或生长调节物质较为困难。
样品的纯化是内源激素或生长调节物质分析
测定的首要工作。许多植物组织通常只采用石油
醚一种萃取剂即可达到满意的纯化效果，但此法
用于薯蓣则效果较差。由于薯蓣组织中酯溶性杂
质种类多，而不同性质的杂质的最佳溶剂并不一
致，这可能是混合萃取法比单一萃取法效果较好
的主要原因。此外，由于薯蓣不同器官中杂质种
类及其含量并不一致，因而提纯方法可作相应变
动。例如，根中杂质种类和含量均较少，混合
萃取 1次就可以达到纯化的目的，PVP的用量也
可减少；而叶片和茎中的色素含量较高，需 3次
萃取；块茎中虽然色素较少，但多糖、多酚等
杂质较多，因而可适当减少萃取次数而增加 PVP
的用量。因此，针对不同器官组分的特点，可
采取灵活的除杂方法，既可提高工作效率，又可
防止内源激素或生长调节物质损失过多而影响结果
的准确性。另外，采用 PVP净化并结合高速离
心，不仅可最大限度地除去酚类杂质，还可使样
品液中的大分子等杂物充分沉淀。因此，溶解有
内源激素或生长调节物质的提取液不需再经复杂的
过柱等纯化程序，但为了防止操作过程中遗留或
不甚带入的杂物，提取液在上样之前还须经过微
孔过滤。我们的结果表明，提取液经高速离心
(7 200×g~8 000×g) 5~8 min后，取其上部液体直
接上样，同样能得到满意的图谱。用本方法，每
人每天可完成 15~20份样品的分析，比已有报道
(陈雪梅和王沙生 1992；陈昆松等 2003)的操作时
间大大缩短。
适宜的色谱条件是内源激素或生长调节物质
准确定量的有力保证，流动相的选择则是测定工
作的重要环节。本文结果表明，薯蓣组分复杂且
性质差异较大，常规的有机溶剂流动相难以将其
内源激素或生长调节物质完全分离，而用中等离
子强度的磷酸缓冲液并采用梯度洗脱方式则可得到
较好的分辨率和分离效果。方能虎和侯树泉
(1998)也认为，无机盐缓冲液梯度洗脱可提高分
离度，改善峰形，提高灵敏度，对组分复杂样
品的分离有较好的效果。但用磷酸缓冲液作为流
动相时应注意：(1)使用前一定要经过 0.45 µm的
表 1 薯蓣块茎膨大期间的不同器官中内源激素含量
µmol·g -1 (FW)
部位 IAA GA3 ABA JA
叶片 1.02±0.07 0.82±0.07 1.48±0.13 17.84±1.01
叶柄 1.16±0.14 0.43±0.03 0.85±0.06 9.06±0.43
块茎 1.41±0.11 0.11±0.01 2.00±0.17 25.33±2.16
根 2.15±0.23 0.04±0.00 0.40±0.03 11.13±0.55
　　表中数值为 5 次重复平均值 ± 标准误。
讨　　论
用HPLC分析植物组织中激素或生长调节物
质的难易取决于组织中组分的复杂程度。一般来
说，组织中组分简单，内源激素或生长调节物质
的提取、纯化和测定较容易；反之，提取和测
定工作难度则大(罗正荣 1990)。薯蓣属植物组织
植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月532
滤膜过滤以防盐沉淀堵塞色谱柱，最好现配现
用；(2)采用超声脱气法除去流动相中的溶解氧；
(3)测试前先用低浓度有机相(如 10%甲醇)作过渡
洗脱剂，防止缓冲液中盐在高浓度有机相中析
出；(4 )测试完毕，依次用 100 % 纯水、甲醇和
水(95:5，V/V)、100%甲醇清洗整个系统 20~30
mi n，以防止盐分残留。
植物体内存在多种内源激素和生长调节物
质，控制贮藏器官形成的内源激素和生长调节物
质的种类远不止此 4种，还有它们的类似物或衍
生物。本文方法对这类物质的定量分析可能也是
可行的，但须深入探讨。
参考文献
陈昆松, 徐昌杰, 李方, 陈青俊, 张上隆(2003). HPLC法测定果实
组织中内源 IAA、ABA方法的改进. 果树学报, 20 (1): 4~7
陈雪梅, 王沙生(1992). HPLC法定量分析植物组织中ABA, IAA
和NAA. 植物生理学通讯, 28 (5): 368~371
丁静, 沈镇德, 方亦雄, 冯秀香, 李琳, 倪晋山(1979). 植物内源激
素的提取分离和生物鉴定. 植物生理学通讯, (2): 27~39
杜黎明, 许庆琴(2000). 气相色谱法分离和测定 3种植物内源激
素. 色谱, 18 (1): 67~69
方能虎, 侯树泉(1998). 植物激素的反相高效液相色谱法分离和
测定. 色谱, 16 (5): 417~420
李鹄鸣, 张晓蓉(1999). 我国薯蓣属植物基础研究进展. 经济林
研究, 17 (2): 43~45
李金永, 石晶, 赵晓亮, 王广, 于惠芬, 任彦军(1994). 高效液相色
谱法分离和测定三种植物内源激素. 分析化学, 22 (8): 801~
804
罗正荣(1990). 植物激素测定方法. 果树科学, 7 (3): 186~190
马崇坚(2003). 马铃薯试管块茎形成与内源生长物质的关系[博士
学位论文]. 武汉: 华中农业大学
马崇坚, 谢从华, 柳俊, 李培武, 张文(2003). 内源生长物质在马铃
薯试管块茎形成中的作用. 华中农业大学学报, 22 (4): 389~
394
谈锋(1986 ). 植物激素的高效液相色谱. 植物生理学通讯, ( 5):
15~23
王庆美, 张力明, 王振林(2005). 甘薯内源激素变化与块根形成
膨大的关系. 中国农业科学, 38 (12): 2414~2420
王若仲, 萧浪涛, 蔺万煌, 曹庸, 卜晓英(2002). 亚种间杂交稻内
源激素的高效液相色谱测定法. 色谱, 20 (2): 148~150
吴颂如, 陈婉芬, 周燮(1988). 酶联免疫法(ELISA)测定内源激素.
植物生理学通讯, (5): 53~54
薛建平, 葛德燕, 张爱民, 柳俊, 朱艳芳(2004). 试管地黄的不定
根膨大过程中 4种内源激素的消长. 作物学报, 30 (10): 1056~
1059
Marschner H, Sattelmacher B, Bangerth F (1984). Growth rate of
potato tubers and endogenous contents of indolylacetic acid
and abscisic acid. Physiol Plant, 60: 16~20
Naktani M, Komeichi M (1991). Changes in the endogenous
level of zeatin riboside, abscisic acid and indole acetic acid
during formation and thickening of tuberous root in sweet
potato. Jpn J Crop Sci, 60: 91~100
Ravnikar M, Žel J, Plaper I, Špacapan A (1993). Jasmonic acid
stimulates shoot and bulb formation of garlic in vitro. J Plant
Growth Regul, 12: 73~77