全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第3期，2006年6月 431
枇杷4-香豆酸CoA连接酶的某些特性
吴锦程* 唐朝晖
莆田学院环境与生命科学系，福建莆田 351100
提要 以枇杷品种‘解放钟’果实为试材，用硫酸铵分级盐析方法提取 4- 香豆酸 CoA 连接酶，其最适温度为 10 和 40℃，
40 和 10℃下的热稳定性较好；最适 pH 为 8.0 且较稳定；最适底物为咖啡酸。
关键词 枇杷；4- 香豆酸 CoA 连接酶；特性
Some Characteristics of 4-Coumarate Coenzyme A Ligase in Loquat (Eriobotrya
japonica Lindl. cv. Jiefangzhong)
WU Jin-Cheng*, TANG Chao-Hui
Department of Environment and Life Science, Putian College, Putian, Fujian 351100, China
Abstract The characteristics of 4-coumarate CoA ligase (4-CL) were investigated by extracting and purifying
with (NH4)2SO4 fraction from the fruits of loquat (Eriobotrya japonica Lindl. cv. Jiefangzhong). The results
showed that the optimal temperatures for the enzyme were 10℃ and 40℃ at which heat stability was better.
The optimal pH was 8.0 when the stability of 4-CL was relatively better, and the optimal substrate was caffeic
acid.
Key words loquat (Eriobotrya japonica Lindl. cv. Jiefangzhong); 4-coumarate coenzyme A ligase (4-CL);
characteristics
收稿 2005-10-31 修定 　2006-02-27
资助 福建省科技厅资助重点课题(2002I023)。
*E-mail: wjc2384@163.com, Tel: 0594-2692891
木质素的生物合成通过植物苯丙烷类次生物
质合成途径，4-香豆酸 CoA连接酶(4-coumarate
CoA ligase, 4-CL, EC 6. 2.1.12)是这一途径中的关
键酶，4-CL 常由多个成员组成的基因家族所编
码，不同基因的表达受发育阶段和环境信号所调
节(余叔文和汤章城1998)。4-CL因其处在由苯丙
烷类代谢向形成不同类型产物的转折点(如木质素
的合成)而备受关注，Grand等(1983)用层析技术
从杨树茎中分离和初步纯化得到4-CL的 3个同工
酶，并发现这 3 个酶在木质化程度较高的木质部
中的活性均较高，而在薄壁组织中活性则很低，
说明4-CL在木质素生物合成中是重要的(欧阳光察
和薛应龙1988)。枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)
为非跃变型果实，采后放在常温下衰老变质较
快，低温气调贮藏虽可有效控制果实腐烂的发
生，但不能阻止果实品质的木质化劣变，因而果
实的感官品质和商品性变差(郑永华等2000；林革
等2004)。本文试图通过枇杷的 4-CL 某些特性分
析，探讨冷藏枇杷果实木质化败坏的原因。
材料与方法
枇杷品种‘解放钟’ (Eriobotrya japonica Lindl.
cv. Jiefangzhong)果实购自福建莆田常太，于正常
食用成熟度时采收，采后当天运回实验室，选择
成熟度、大小基本一致、无病虫害和机械损伤的
果实保存于4℃冰箱中。咖啡酸(caffeic acid)、没
食子酸(gallic acid)、阿魏酸(ferulic acid)和香豆酸
(p-coumaric acid)为 Flucka公司产品；肉桂酸
(cinnamic acid)购自Alfa Aesar公司；ATP和CoA
(coenzyme A)为 Sigma 公司分装产品；其他试剂
均为国产分析纯。
酶液提取参照毕咏梅和欧阳光察(1990)的方
法。取10.0 g枇杷果肉加入0.2 mol·L-1 Tris-HCl
缓冲液(含25.0%甘油和0.1 mol·L-1的DTT，pH 8.0)，
捣碎后用 4 层纱布过滤，以 10 000×g 离心 20
m i n，上清液即为粗酶。粗酶液加入硫酸铵至
4 5 % 饱和度，离心除去沉淀，上清液再加硫酸
铵达75%饱和度，离心收集沉淀，以0.001 mol·L-1
pH 8.0磷酸缓冲液于4℃下透析过夜，得到的酶
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液保存于 4℃冰箱中待测。
酶活性测定参照Knobloch和Hahlbrock (1977)
的方法。3.0 mL 反应液中含15 mmol·L-1 的 Mg2+
0.45 mL、5 mmol·L-1 的4-香豆酸 0.15 mL、1.0
mmol·L-1 的CoA 0.15 mL、50 mmol·L-1 的ATP 0.15
mL、0.5 mL 酶液、0.2 mol·L-1 的Tris-HCl 溶液
1.6 mL。于40℃恒温水浴中反应10 min后测其在
波长333 nm 的吸光值，以变化 0.001 个 OD 值为
1 个酶活力单位，对照不加香豆酸。
分别用0.15 mL 5 mmol·L-1 的咖啡酸、没食
子酸、香豆酸、肉桂酸、阿魏酸为底物测酶活
性(反应体系的pH为 8.0，温度为40℃)，其中没
食子酸、香豆酸、肉桂酸的吸收峰为 333 nm，
咖啡酸的吸收峰为362 nm，阿魏酸吸收峰为345
nm，测定重复 3 次，以 OD 值变化 0.001 为 1 个
酶活力单位。
测定最适温度及热稳定性时，以咖啡酸为底
物, 酶促反应液于不同温度(范围10~60℃，pH 8.0)
下保温10 min 后测定活性。热稳定性测定时，将
酶促反应液于不同温度(范围10~60℃，间隔10℃,
pH 8.0)下保温，每隔5 min 测活性1次，测定重
复 3 次。
最适pH值测定以咖啡酸为底物，酶促反应液
置于不同pH 值(范围 3.0~10.0，间隔 1.0，温度
40℃)的缓冲液中测定活性。测定 pH 稳定性时，
将酶促反应液置于不同pH的缓冲液中40℃保温20
min后测酶残余活性(以最大活性管的相对活性为
100 % )。测定重复 3 次。
木质素含量测定参照朱海英等(1997)的方法。
取6.0 g枇杷果肉于研钵中研碎，精确称取1.0 g
置于小烧杯中并加入 70% 硫酸 6 mL，35℃中恒
温水浴不断搅拌，1 h后用 208.0 mL蒸馏水冲洗
到 250 mL 的三角瓶中，用牛皮纸封口后 20℃高
压灭菌 1 h，之后将此溶液以 G4 砂心漏斗过滤并
用热水冲洗，置于60℃干燥箱烘干至恒重，计算
按木质素的重量=干燥后砂心漏斗重量-砂心漏斗
净重，结果以木质素占果肉鲜重的百分比[ %
(FW)]表示，测定重复 3 次。
以上测定所得数据均用 3 次重复的平均值；
Duncan’s 新复极差法进行方差分析，检验差异显
著性。
结果与讨论
1 底物、温度和pH 对枇杷 4-CL 活性的影响
表1和图1~3显示:
(1)不同底物表现出不同的酶活性，以香豆酸
的活性为 100 % 计算，咖啡酸为 125 %，没食子
酸为62.5%，肉桂酸为62.5%，阿魏酸为31.25%;
以咖啡酸为底物的酶活性分别比香豆酸、没食子
酸、肉桂酸和阿魏酸高 25%、62.5%、62.5% 和
93.75%，差异均达极显著水平(P<0.01)。各底物
的4-CL酶活性大小顺序为：咖啡酸>香豆酸>没食
子酸、肉桂酸>阿魏酸。枇杷 4-CL 对咖啡酸和香
豆酸有较高的活性，与其他植物材料的报道一致
(毕咏梅和欧阳光察 1990；王隆华等 1997)，但
枇杷4-CL 对咖啡酸活性最高，而水稻 4-CL 对香
豆酸表现最大活性(毕咏梅和欧阳光察1990)，说
明不同植物的4-CL 特性存在差异(表 1)。
(2)在 10~30℃内，温度上升则酶活性降低；
在 1 0 和 4 0 ℃时酶活性高于其它试验温度的
15.8% 以上，差异达极显著水平(P<0.01)。当温
度超过 40℃时，随温度的升高，酶活性下降(图
1)。 因此，枇杷加工时用热烫可使多酚氧化酶失
表1 不同底物的枇杷4-CL活性
Table 1 Characteristics of different substrates
for the loquat 4-CL activity
底物 4-CL酶活性/%
咖啡酸(caffeic acid) 125
没食子酸(gallic acid) 62.5
香豆酸 (p-coumaric acid) 100
肉桂酸(cinnamic acid) 62.5
阿魏酸(ferulic acid) 31.25
图1 温度对枇杷4-CL活性的影响
Fig.1 Effect of temperatures on loquat 4-CL activity
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活以减轻褐变产生，同时也促使4-CL失活阻止果
肉木质化。4-CL在40℃保温10 min后的酶活性比
10℃高 9.8%，差异达显著水平(P<0.05); 而比在
20、30、50 和 60℃保温 10 min 后的酶活性均高
出20% 以上，差异达极显著水平(P<0.01)。4-CL
在40℃时酶活性相对较为稳定，10 min后仍可保
留 80% 以上的酶活性；其次是 10℃时 4-CL 在保
温 10 min 后仍可保留 70% 以上的酶活性；4-CL
在 20℃时保温，酶活性快速下降，20 min后酶活
性丧失，稳定性最差(图2)。温度对 4-CL活性影
响较大，毕咏梅和欧阳光察(1990)在研究水稻4-CL
特性后认为 4-C L 最适温度为 40℃且热稳定性
好；枇杷 4-CL 与水稻一样，在 40℃时表现活性
较高且热稳定性好，但枇杷4-CL在10℃低温时同
样具有较高的活性。枇杷果实常温贮藏果肉木质
化程度较低，而低温贮藏果肉木质化程度较高，
冷藏枇杷果肉发生严重的木质化败坏可能与4-CL
低温时酶活性较高相关，其内在机制有待进一步研
究 。
8.0。
2 冷藏过程中的枇杷果实木质素含量变化
如图4 所示，枇杷果实冷藏过程中木质素含
量呈上升趋势。其中，在第 14~21 天和第 28~35
天期间木质素含量增加较为明显，分别为果实冷
藏其它时期木质素增长量的1.67和 1.78倍以上，
差异达极显著水平(P<0.01)。枇杷果实冷藏 35
d，因严重木质化而基本丧失商品价值，说明果
实冷藏期的第14~21天和第28~35天是枇杷果实品
质木质化劣变的重要时期。
图2 枇杷4-CL的热稳定性
Fig.2 Heat stability of loquat 4-CL
图3 pH对枇杷4-CL活性的影响
Fig.3 Effect of pH on loquat 4-CL activity
图5 枇杷冷藏期间4-CL活性的变化
Fig.5 Changes in 4-CL activity of loquat at cold storage
图4 枇杷果实冷藏过程中木质素含量的变化
Fig.4 Changes in lignin of loquat at cold storage
(3)当pH 4.0时酶活性呈现一个小的高峰，但
酶活性不高；pH 6.0~8.0时酶活性显著上升，pH
为 8.0 的酶活性最高，pH>8.0 时酶活性开始下降
(图 3)。‘解放钟’枇杷果实在贮藏过程中酸度
不断下降，pH 值上升，果实贮藏早期 pH 值较低
(何志刚等2005)。本文结果显示，当pH在3.0~6.0
较低时，枇杷 4-CL 活性较低，生物合成木质素
少，与果实贮藏早期木质素含量呈现缓慢上升的
结果相吻合。果实贮藏 14 d 后，木质素含量上
升较快(图 4、5)，这可能与贮藏过程中 pH 值上
升而提高4-CL活性有关。枇杷4-CL最适 pH值为
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3 枇杷果实冷藏过程中的枇杷4-CL活性变化
从图5可以看出，贮于4℃下的枇杷果实4-CL
活性在前14 d内呈上升趋势，14 d后开始下降，
呈现先升后降的变化规律。贮藏的前 7 d 内果实
4-CL活性差异不显著(P>0.05)，贮藏 7 d后果实
4-CL 活性上升最快，14 d 时达到峰值，差异达
极显著水平(P<0.01)。14 d后仍然继续下降，但
21 d 后下降趋缓，并仍高于贮藏前 7 d 的。
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