全 文 ：植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月 137
冰冻保存小新月菱形藻的包埋-玻璃化法
张丽佳，王起华*，张恩栋，刘丽娜
辽宁师范大学生命科学学院，辽宁大连 116029
Cryopreservation of Nitzschia closterium minutissima Allen et Netson by En-
capsulation-vitrification Method
ZHANG Li-Jia, WANG Qi-Hua*, ZHANG En-Dong, LIU Li-Na
School of Life Sciences, Liaoning Normal University, Dalian, Liaoning 116029, China
提要：采用包埋 - 玻璃化法对小新月菱形藻进行冰冻保存，探讨玻璃化溶液(PVS)配方、装载液浓度和装载时间、脱水时
间以及洗涤方法对冰冻保存存活率的影响。结果表明：小新月菱形藻在 0℃预冷后 50% PVS2 装载 60 min，100% PVS2
脱水 60 min，1 mol·L-1 蔗糖梯度洗涤 30 min 的条件下存活率最高，为 74.1%。包埋 - 玻璃化法不需要特殊的冷冻设备，冰
冻程序操作简单，在藻类种质的超低温保存中有较大的应用潜力。
关键词：小新月菱形藻；包埋 - 玻璃化；存活率；冰冻保存
收稿 2006-08-16 修定 　2006-12-11
资助 国家自然科学基金(30470184)。
*通讯作者(E-mail：qihua_mail@163.com；Tel：
0411-84258039)。
近年来，随着海洋微藻在鱼、虾、贝类育
苗生产中的广泛应用，有关饵料微藻的超低温保
存的研究日益受到重视。小新月菱形藻是海产养
殖中的一种优良饵料微藻，对其超低温保存的探
索有重要的应用价值。王起华等(1999)曾采用两
步法冰冻保存小新月菱形藻并获得 63.1% 的较高
存活率，但是他们的方法需要采用特殊的降温设
备和较为复杂的冷冻程序，其实际应用受到很大
的限制。玻璃化法和包埋脱水法是近20年来建立
的 2 种超低温保存新技术，毋需昂贵的降温设
备，冷冻程序比较简单，在多种植物种质超低温
保存中已显示出巨大的应用潜力。近10年来，新
发展的包埋-玻璃化法则结合包埋脱水法和玻璃化
法的多种优点于一身，现已在20余种高等植物的
种质保存中获得成功(梁宏和王起华2005；吴雪梅
和汤浩茹2005)。本文采用包埋-玻璃化法冰冻保
存小新月菱形藻，并探讨了玻璃化溶液组成、脱
水时间、装载液浓度、装载时间以及洗涤方法对
其存活率的影响，以探求一条不需要特殊设备、
操作简便而且存活率较高的冰冻保存小新月菱形藻
的方法。
材料与方法
1 材料及其培养
小新月菱形藻(Nitzschia closterium minutissima
Allen et Nelson)由辽宁省水产研究所提供，并由
我校藻类生理研究室纯化为单种。取 25 mL 生长
6 d的小新月菱形藻(8.14×106个·mL-1)，接种于含
有100 mL f/2培养基(Mclachlan 1973)的250 mL的
三角烧瓶中。培养条件为(22±1) ℃，光照强度
(43±3) mmol·m-2·s-1，光周期(光/暗)为14 h/10 h。
取培养10 d的材料(静止期)用于冷冻保存。
2 植物玻璃化溶液(PVS)的组成和配制
以PVS2配方(Sakai等1990)为基础，通过改
变二甲基亚砜( D M S O ) 的浓度或用聚乙二醇
(PEG20000)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)分别代替
DMSO，配成 6 种不同配方。PVS7 配方参照文献
(Wu 等 2003)，并稍作改动。
上述7种 PVS 配方的组成有：PVS1 [30% 甘
油(GLY) (W/V, 单位下同)+15% 乙二醇(EG)+10%
D M S O ]、P V S 2 ( 3 0 % G L Y + 1 5 % E G + 1 5 %
D M S O )、P V S 3 ( 3 0 % G L Y + 1 5 % E G + 2 0 %
D M S O )、P V S 4 ( 3 0 % G L Y + 1 5 % E G + 2 5 %
DMSO)、PVS5 (30% GLY+15% EG+6% PEG)、
PVS6 (30% GLY+15% EG+5% PVP)和 PVS7 (50%
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月138
GLY+50% 蔗糖)。PVS1~6 用含 0.4 mol·L-1 蔗糖的
f/2 培养基定容，PVS7 用 f/2 培养基定容。
25% PVS 装载的预备实验结果表明，PVS3
对小新月菱形藻的冰冻保存效果最好，因此，本
文的脱水和装载处理均采用 PVS3。
3 包埋
取上述培养10 d的小新月菱形藻，离心后用
灭菌海水悬浮至适当密度，与30‰ NaCl的 6%褐
藻酸钠溶液等体积混匀后，制成直径约2.5 mm的
胶球，参照王起华等(2005)的方法。将此胶球置
于灭菌海水中，暗恢复 1 d 后备用。
4 装载和脱水
装载时，将每组 45 个胶球分别置于装有 20
mL 25% 和 50% PVS 溶液的 50 mL 三角瓶中，在
0 ℃预冷后进行装载处理，时间分别为 0、20、
40、60、80 和 100 min。脱水时，将经过装载
的胶球置于装有 20 mL 100% PVS 溶液的三角瓶
中，在0 ℃预冷后进行脱水处理，时间分别为0、
20、40、60、80 和 100 min。
5 冰冻、化冻和洗涤
将脱水后的胶球每15个为1组，移入冻存管
中，加入 1 mL 新鲜的 100% PVS 溶液，快速投
入到液氮中保存，放置24 h后，在 40 ℃水浴下
快速化冻。此操作按王起华等(2005)的方法进
行。洗涤：(1)蔗糖梯度洗涤时，将化冻后的每
组胶球移入含20 mL 1 mol·L-1蔗糖的三角瓶中20
℃振荡 15 min，然后再加入20 mL f/2培养基振
荡10 min，最后加入20 mL f/2培养基振荡5 min。
(2) 0.4 mol·L-1蔗糖于20 ℃下振荡洗涤30 min。
(3) 1 mol·L-1蔗糖于20 ℃下振荡30 min。(4) 1.2
mol·L-1蔗糖于20 ℃下振荡30 min。(5) f/2培养基
于 0 ℃振荡 30 min。除特殊说明外，均采用蔗
糖梯度洗涤。
6 恢复培养和存活率的测定
将洗涤后的每组胶球放入装有20 mL f/2培养
基的50 mL 三角瓶中，在与培养材料相同的条件
下暗中恢复 1 d，再光照培养 4 d 后，用丙酮提
取叶绿素计算存活率。具体方法参见王起华等
(2005)。
上述实验至少重复 2 次，每次实验设置 3 个
平行样品，文中数据为 6 个平行样品的平均值和
标准差。
结果与讨论
1 PVS3脱水时间对小新月菱形藻冰冻保存存活率
的影响
由图 1 可以看出，25% PVS3 装载的材料在
80 min 时的存活率最大，为 35.1% ；50% PVS3
装载的材料在60 min时达到最大存活率(57.7%)。
50% PVS3 装载的脱水效果显著好于 25% PVS3 装
载的。玻璃化保护剂脱水时间过短，藻细胞仍保
持较高的含水量，在降温过程中不能迅速达到玻
璃化状态，因而不易成活；脱水时间过长，藻
细胞受玻璃化溶液的毒害增大，成活率反而下降
(梁宏和王起华2005)。前人的研究表明，玻璃化
保护液的处理时间与实验材料的性质有关。对于
高等植物来说，悬浮培养物和原生质体要求时间
短，而茎尖等外植体可承受较长的处理时间(梁宏
和王起华 2005)。近年来，采用常规玻璃化法保
存藻类材料已有几例报道，最佳脱水时间分别
为：莱因衣藻5 min (项黎新和邵健忠2001); 小球
藻1 h (蔡小宁等2004); 条斑紫菜叶状体细胞的原
生质体3 min (Liu等2004)。玻璃化保护液的处理
时间还可能与玻璃化保存方法有关。采用新发展
的包埋-玻璃化法保存高等植物材料的初步结果表
明，此法的最适脱水时间比常规玻璃化法长得
多，如橄榄树体细胞胚为3 h (Shibli和Aljuboory
2 0 0 0 )；山嵛菜顶端分生组织为 70~ 1 0 0 m i n
(Matsumoto 等 1995)。本文结果与保存高等植物
材料的结果相近。采用褐藻胶包埋细胞，一方面
可以减缓渗透性保护剂渗入细胞的速率，另一方
图1 脱水时间对小新月菱形藻存活率的影响
植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月 139
面由于褐藻胶本身是亲水胶体，在含有藻细胞的
胶球脱水时，褐藻胶可以起缓冲作用，这些都可
以降低脱水速率，减缓脱水过程中细胞内外的渗
透压差，因而细胞在脱水过程中可以得到保护。
2 PVS3装载液浓度和装载时间对小新月菱形藻冰
冻保存存活率的影响
根据上述最适脱水时间进行装载实验的结果
(图2)表明， 25%和50% PVS3 处理下的小新月菱
形藻冰冻保存后的存活率都在60 min时达到最高
(分别为42.7% 和 66.4%)。50% PVS3 的装载效果
显著好于 25% PVS3。
PVS3 可获得最大存活率(42.2%)。而用 50% PVS
装载时，P V S 2 可获得最大存活率( 7 1 . 9 % ) 。
PVS1~ PVS 4 四者的差别是 DMSO 浓度不同，依
次为 10%、15%、20% 和 25%。PVS1~PVS4 所
对应的处理结果如下：25% PVS 装载下的存活率
分别为6.1%、20.3%、42.2% 和 14.4%；50% PVS
装载下的存活率分别为11.4%、71.9%、64.3% 和
18.7%。在我们的实验中，用15% 和 20% 的 DMSO
可获得最高或较高的存活率。此外，采用 PV S 7
保护液也有一定的存活率。而PVS5 和 PVS6 的存
活率都为零。
在用玻璃化溶液进行脱水处理前，为避免由
于渗透压变化对细胞造成的伤害，通常有一个装
载的过程(梁宏和王起华2005)。装载溶液大多采
用2 mol·L-1甘油和0.4 mol·L-1蔗糖的混合液或稀释
的玻璃化溶液(梁宏和王起华2005)。用常规玻璃
化方法保存的装载时间通常都较短，小球藻为20
min (蔡小宁等2004) ；条斑紫菜原生质体为5 min
(Liu等2004)。而用包埋-玻璃化法保存材料的装
载时间相对要长得多，如马铃薯分生组织为 9 0
min (Hirai和Sakai1 1999)。本文中，小新月菱形
藻的最佳装载时间为60 min，这也与保存高等植
物材料的结果相近，说明采用包埋玻璃化法保存
藻类材料时，最佳脱水时间和装载时间都比常规
玻璃化法明显增长。
3 玻璃化保护液种类对小新月菱形藻冰冻保存存
活率的影响
根据上述装载和脱水处理的实验结果，对适
合小新月菱形藻冰冻保存的 PVS 保护液配方进行
筛选的结果(表 1)显示，25% PVS 装载时，采用
与传统的保存方法不同，玻璃化法没有繁琐
的降温过程，因此，玻璃化保护剂的筛选和处理
是玻璃化冻存的关键。已有研究表明，植物的玻
璃化保存多数采用PVS2 配方，即30% GLY+15%
EG+15% DMSO，以含 0.4 mol·L-1 蔗糖的 MS 培养
基定容(梁宏和王起华2005)，或在此配方基础上
所做的修改，如莱因衣藻采用 30 % G L Y + 1 5 %
DMSO+0.5 mol·L-1蔗糖(项黎新和邵健忠2001) ；小
球藻采用30% 蔗糖 +15% EG+10% DMSO (蔡小宁
等2004)。本文结果表明，PVS2 配方冰冻保存小
新月菱形藻可以获得很高的存活率，而以 PEG 或
PVP等非渗透性保护剂代替PVS2 中的渗透性保护
剂 DMSO 的配方，即本文中的 PVS5 和 PVS6 都
不适合于小新月菱形藻的冰冻保存[尽管含有PEG
或 PVP 的玻璃化保护剂已经证明是适用于某些植
物的冰冻保存(刘云国和王晓云2002)]。PVS7 曾
成功地用于冰冻保存苹果茎尖(Wu 等 1999)等材
图2 装载时间对小新月菱形藻存活率的影响
表1 PVS种类对小新月菱形藻冰冻保存存活率的影响
PVS种类
小新月菱形藻存活率/%
25% PVS装载60 min和 50% PVS装载60 min和
100% PVS脱水80 min 100% PVS脱水60 min
PVS1 6.1 (1.5) 11.4 (2.5)
PVS2 20.3 (4.0) 71.9 (7.1)
PVS3 42.2 (4.5) 64.3 (5.5)
PVS4 14.4 (2.6) 18.7 (1.1)
PVS5 0 0
PVS6 0 0
PVS7 6.7 (2.3) 24.7 (2.5)
　　括弧内的数值为标准差。
植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月140
料，但本文采用此配方保存小新月菱形藻的效果
并不理想。
4 洗涤液中蔗糖浓度和洗涤方式法对小新月菱形
藻冰冻保存存活率的影响
我们分别采用蔗糖梯度和单一蔗糖浓度的洗
涤液对化冻后的胶球进行洗涤的结果(图 3)表明，
蔗糖梯度洗涤的存活率最高(74.1%); 其次是 1.2
mol·L-1 蔗糖洗涤，其存活率为71.2%。与常规的
超低温保存不同，在玻璃化冻存中，由于保护剂
的浓度很高，化冻后洗涤是重要的。较常采用的
洗涤液是含1.2 mol·L-1蔗糖的培养基，也有采用
不同浓度山梨醇溶液洗涤的(梁宏和王起华2005)。
本文采用蔗糖梯度洗涤的效果好于单一浓度蔗糖洗
涤的，这可能是梯度洗涤时细胞内外渗透压逐步
改变，从而可减少对细胞的伤害。至于其他因素
对洗涤的影响还需进一步研究。
需特殊设备，用简单的冰冻程序也可得到高达
74.1%的存活率。表明包埋-玻璃化法在藻类种质
的超低温保存中可能有一定的应用潜力。
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尽管采用两步法冰冻保存小新月菱形藻可以
得到63.1%的较高存活率(王起华等1999)，但由
于此法需要比较贵重的降温设备和复杂的冷冻程
序，以致其应用受到限制。近年来，我们也曾
尝试用不需要特殊设备且操作比较简单的包埋脱水
法冰冻保存几种海洋饵料硅藻，但存活率都很
低，如牟氏角刺藻存活率为30% (李莹等 2003)，
而小新月菱形藻仅为18.3% (未发表资料)，都明
显低于两步法冰冻保存的存活率(王起华等1999)。
本文采用包埋 - 玻璃化法保存小新月菱形藻，毋
图3 洗涤液中蔗糖浓度和洗涤方式
对小新月菱形藻存活率的影响