全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月664
红果人参叶中 cDNA文库的构建
杨成君 1，王军 1,*，刘关君 1，王英平 2
1东北林业大学林学院，哈尔滨 150040；2中国农业科学院特产研究所，吉林吉林 132109
提要：以四年生红果人参叶片为材料，提取叶中总 RNA合成 cDNA，连接到质粒载体 pDNR-LIB上。采用电穿孔法将
重组质粒转化到 DH5α中。经文库质量鉴定表明：原始文库滴度为 1.008×106 pfu·mL-1，扩增后的文库滴度为 2.968×109
pfu·mL-1，重组率接近 100%，插入片段大小在 0.5~2 kb之间，平均为 0.85 kb，表明已成功构建了红果人参叶中 cDNA文
库。
关键词：红果人参；cDNA文库；构建
Construction of cDNA Library from Panax ginseng C. A. Mey. cv. Hongguo
Leaves
YANG Cheng-Jun1, WANG Jun1,*, LIU Guan-Jun1, WANG Ying-Ping2
1College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2Institute of Special Wild Economic Animal and Plant
Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Jilin, Jilin 132109, China
Abstract: The four years old Panax ginseng cv. Hongguo was used as experimental material, and total RNA
was extracted from the leaves, cDNA was synthesized and ds cDNA fragment was ligated into the pDNR-LIB
vector. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli DH5α by electroporation. The library
qualification evaluation showed, the titer of primary cDNA library was 1.008×106 pfu·mL-1, the titer of amplified
library was 2.968×109 pfu·mL-1, the recombination percentage was about 100%, inserted fragment size
was 0.5~2 kb, average inserted size was 0.85 kb. The Panax ginseng cv. Hongguo cDNA library was con-
structed successfully.
Key words: Panax ginseng cv. Hongguo; cDNA library; construction
收稿 2007-04-06 修定 2007-06-19
资助 国家林业局野生动植物保护项目(0 10 -4 13 25 5)。
致谢 采集人参材料的过程中，沈育杰先生和尤伟先生曾给
予大力支持。
* 通讯作者(E-ma i l : ju nwa ng1 9 6 6 @ya ho o.com.cn；
T el：0 4 5 1 -8 2 1 9 1 8 2 9 )。
人参为五加科人参属植物，别名棒槌，素有
“东北三宝”之称。目前，对人参的研究多集
中在有效成分、结构、生物活性、药理和临床
应用。而人参功能基因和次生代谢生物合成途径
的研究相对较少，完整的基因组和草图序列还有
待于建立。cDNA文库筛选和植物表达序列标签
(expressed sequence tag，EST)等分子生物技术可
应用于药用次生代谢调控机制研究以及功能基因的
克隆、表达和鉴定等(黄璐琳等2005)。构建 cDNA
文库是研究功能基因组学的基本手段之一，目前
已广泛用于研究不同发育阶段基因表达的变化、
某特定发育期基因的表达情况、克隆新型细胞因
子和分离新的组织特异基因等(Peterson 等 1998；
Galaud 等 1999)。本文以 pDNR-LIB为载体，构
建了四年生红果人参叶片的 cDNA文库，为从分
子水平上研究人参的功能基因及其调控机制积累基
础性资料。
材料与方法
四年生红果人参(Panax ginseng C. A. Mey. cv.
Hongguo)采自吉林省抚松县。CreatorTM SMARTTM
cDNA文库构建试剂盒购自 Clontench公司。感受
态细胞为大肠杆菌 Electro-cells DH5α， DL2000
DNA分子量购自 TaKaRa 生物技术公司；RQ1
RNase-Free DNase购自 Promega公司；其他常规
试剂均为国产分析纯。
提取叶片总 RNA时，在 1.5 mL的离心管中
加入 600 µL的提取缓冲液(2% SDS、0.0125 mol·L-1
四硼酸钠、100 mmol·L-1 NaCl、10 mmol·L-1
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月 665
EDTA，pH 8.0)、10%的 β-巯基乙醇。取 200
mg叶片，在液氮中研磨成粉末，迅速加入其中。
然后加入 300 µL Tris平衡酚和 300 µL氯仿，震
荡 10 min后，于 4 ℃以 13 000×g离心 10 min，
取上清液；再加 Tris平衡酚、氯仿各 300 µL，
重复抽提 1次，取上清液；向其中加入 600 µL
的氯仿，震荡 5 min，于 4 ℃以 13 000×g离心 5
mi n，取上清液；然后加入等体积的异丙醇(预
冷)，混匀后，于 -20 ℃下沉淀 20 min；再于 4
℃下以 13 000×g离心 15 min，弃去上清液；加
入 40 ℃ DEPC水，然后再加入 5 µL DNase和 5
µL RQ1 RNase-Free DNase 10×反应缓冲液[400
mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8.0)、100 mmol·L-1 MgSO4
和 10 mmol·L-1 CaCl2]，37 ℃下放置 30 min后，
用 100 µL的DEPC水稀释，然后加入等体积的氯
仿抽提 1 次，取上清液加入等体积的异丙醇(预
冷)，于-20 ℃下沉淀30 min；再于4 ℃下以13 000×
g离心 15 min，弃去上清液，以 75%的乙醇(预
冷)洗涤 1次，空气中干燥，用适量的DEPC水溶
解沉淀，置于 -70 ℃下保存备用。以 1.1%的琼
脂糖凝胶上电泳检测RNA的纯度和是否降解，用
紫外分光光度计测定含量。
合成 cDNA第一链时，按照 Clontench公司
CreatorTM SMARTTM cDNA文库构建试剂盒说明
书，在无菌的 PCR管中加入下列试剂：1.1 µL (约
1 µg)总 RNA、1 µL SMART IV寡聚核苷酸、1
µL CDS III/3 PCR引物，加 1.9 µL去离子水至 5
µL。混匀，短暂离心，于 72 ℃下放置 2 min，
取出放置在冰上冷却 2 min，再加入 2 µL 5×第一
链缓冲液、1 µL DTT (20 mmol·L-1)、1 µL dNTP
(10 mmol·L-1)、1 µL反转录酶，反应体积共 10
µL，42 ℃下反应 1 h；冰上终止第一链 cDNA
的合成。
LD-PCR合成 ds cDNA时，于 95 ℃下预热
PCR热循环仪；在无菌的 PCR管中加入下列试
剂：2 µL cDNA第一链产物、80 µL去离子水、
10 µL 10×PCR缓冲液、2 µL 50×dNTP、2 µL 5
PCR引物、2 µL CDS III/3 PCR引物和 2 µL
50×DNA聚合酶，反应的总体积 100 µL。反应条
件：95 ℃中预变性 1 min；95 ℃变性 15 s，68
℃延伸 6 min，共 23个循环；至 4 ℃时结束反
应。取 5 µL反应产物进行 1.1%的琼脂糖电泳鉴
定产物。
蛋白酶K与 SfiI限制性酶消化时，取无菌的
1.5 mL离心管，加入 50 µL扩增 ds cDNA和 2 µL
蛋白酶 K (20 µg·L-1)，混匀，7 500×g离心 2 s，
置于 45 ℃下 20 min，再以 7 500×g离心 2 s，加
50 µL去离子水及 100 µL酚、氯仿和异戊醇(25:
24:1)混合液，并轻轻振荡混合 1 min后，于室温
下以 14 000×g离心 5 min，取上清液放到无菌的
离心管中，加入 100 µL氯仿和异戊醇(24:1)，轻
轻混匀，再以 14 000×g离心 5 min，取上清液放
到无菌的离心管中，加入 10 µL 3 mol·L-1醋酸钠、
1.3 µL糖原(20 µg·µL-1)和 260 µL 95%的乙醇，
立即于室温下以 14 000×g离心 20 min。弃上清
液，用 100 µL 80%乙醇洗沉淀，于空气中干燥
约 10 min后，加 79 µL去离子水重新溶解沉淀。
在含有 79 µL溶剂的离心管中加入下列试
剂：10 µL 10×限制性内切酶缓冲液、10 µL限
制性内切酶、1 µL 100×牛血清白蛋白，反应体
系共 100 µL，混匀，50 ℃下放 2 h，加 2 µL
1 %二甲苯腈蓝，混匀。
分级分离 cDN A 时，根据试剂盒操作说明
书，准备 Chroma SPIN-400柱和 18个 1.5 mL的
离心管，摇匀柱内基质，打开顶盖，让柱内的
贮存缓冲液流尽后加 700 µL柱缓冲液洗柱，自然
流完后，轻轻把 1 0 0 µL 经二甲苯腈蓝染色的
cDNA加到基质表面中央。静止片刻，让样品完
全吸收，用 100 µL柱缓冲液洗涤含有 cDNA离心
管，小心加到基质表面，自然流干后，二甲苯
腈蓝渗透至柱子表面下的几毫米处。放好第一收
集管，加 600 µL柱缓冲液，收集洗脱液，每管
1滴。每管取3 µL进行 1.1%琼脂糖凝胶电泳(150
V) 10 min。收集符合要求的 3~4管合并。向其中
加入 1/10体积的醋酸钠(3 mol·L-1，pH 4.8)、1.3
µL糖原和 2.5倍体积的 95%乙醇(-20 ℃)，混匀，
于-20 ℃中过夜后以 14 000×g离心 20 min，弃去
所有液体，于空气中干燥 10 min，加 7 µL去离
子水溶解沉淀(准备连接载体)。
cDNA与pDNR-LIB载体连接时，设3个连接
梯度反应(表 1)。反应体系为 5 µL，于 16 ℃下
以过夜。每管加 95 µL二已基焦碳酸酯处理水、
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月666
1.5 µL糖原和 280 µL预冷的 95%乙醇，混匀。
置于-70 ℃下 2 h后，以 15 000×g离心 20 min。
弃去上清液，于空气中干燥后，用 5 µL二已基
焦碳酸酯处理水溶解沉淀。
重组质粒转化、文库质量鉴定及其文库扩增
时，取 3 份感受态细胞大肠杆菌 Elect ro -cel l s
DH5α (50 µL)，分别加入上述连接产物，混匀
后进行电转化反应。取感受态细胞和连接产物的
混合液注入到冰中预冷的 0.1 cm冲击槽内，15
kV·cm-1，脉冲时间为 5 ms。迅速置于冰中冷却，
加入 1 mL的 LB培养基，于 37 ℃下振荡培养 1 h
(225×g)，培养物即是原始文库。取培养物的稀
释液涂布于含 30 µg·µL-1氯霉素的 LB培养基平板
上，于 37 ℃中培养过夜，第 2天检查平板。随
机挑取 18个单菌落培养，进行菌液PCR鉴定，使
用M13引物，其反应体系为：1 µL菌液、2.5 µL
10×PCR缓冲液、0.5 µL dNTP (10 µmoL·L-1)、0.5 µL
正向引物(20 µmoL·L-1)、0.5 µL反向引物(20
µmoL·L-1)、19.5 µL去离子水、0.5 µL 50×DNA
聚合酶。反应参数：94 ℃ 30 s；94 ℃ 30 s，
68 ℃ 2 min，进行 25个循环反应；68 ℃ 6 min。
反应结束后取 5 µL PCR产物进行 1.1%的琼脂糖
凝胶电泳检测扩增产物，确定文库重组率和插入
片段的大小。原始文库不稳定，可按照试剂盒上
的说明书测定原始文库的滴度，文库的滴度以每
毫升含噬菌斑形成单位(plague forming unit，pfu)
的数目计算。根据滴度在 LB琼脂板上扩增文库，
文库扩增后加 25%的甘油置于-80 ℃下保存。
实验结果
1 红果人参总RNA的提取
提取的总RNA经核酸测定仪测定其紫外吸收
值，OD260/280为 1.98，表明获得的RNA纯度较高，
经 1.1%的琼脂糖凝胶电泳结果(图 1)显示，28s
rRNA和 18s rRNA条带清晰，亮度比接近 2:1，没
有基因组DNA，说明总RNA没有降解，比较完整，
其纯度和完整性均符合建立 cDNA文库的要求。
表 1 cDNA与载体连接反应的体系
Table 1 Components of reaction of ligation cDNA into vector
µL
cDNA 0.1 µg·µL-1 pDNR-LIB 10×连接缓冲液 10 mmol·L-1 ATP T4 DNA连接酶 去离子水
连接反应 A 0.5 1.0 0.5 0.5 0.5 2.0
连接反应 B 1.0 1.0 0.5 0.5 0.5 1.5
连接反应 C 1.5 1.0 0.5 0.5 0.5 1.0
　　连接缓冲液组分：500 mol·L-1 Tris-HCl (pH7.8)、100 mol·L-1 MgCl2、100 mol·L-1 DTT、0.5 mg·mL-1牛血清白蛋白。
图 1 红果人参叶中总RNA的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.1 Agarose gel electrophoretogram of total
RNA from P. ginseng cv. Hongguo
2 红果人参ds cDNA的合成
反转录后第一链 cDNA经过 LD-PCR合成 ds
cDNA。经 1.1%琼脂糖凝胶电泳检测，ds cDNA
片段条带分布在 0.2~3.0 kb (图 2)。进一步表明
RNA质量合格，降解量少，ds cDNA的长片段
较多，已经符合建库要求。
3 红果人参 cDNA的分级分离
ds cDNA经过蛋白酶K消化和SfiI酶切后，然
后在经过 Chroma SPIN-400柱分级分离。收集片
段大小不同等级的 cDNA片段，共收集 18个离心
管，每管一滴。分离结束后，每管取 3 µL进行
1.1%琼脂糖凝胶电泳。电泳时间不要太长，10
min左右，否则条带模糊，无法辨认。电泳结果
(图 3)表明：1~7管几乎没有 cDNA片段；从第 8
管开始出现 cDNA弥散片段，并且 cDNA的片段
逐渐变小；8~11管中的 cDNA长片段多，基本大
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月 667
于 500 bp；从 12管以后开始有明显小于 500 bp
的片段，舍去 12管以后的 cDNA片段，避免过
多的小片段与载体优先连接。因此，合并 8~11
管的 cDNA用于连接。
4 cDNA文库的构建与文库质量的鉴定
在 3个 cDNA与 pDNR-LIB载体连接反应中，
连接反应C效果最好，cDNA与载体比例为1.5:1。
滴度为 1.008×106 pfu·mL-1。对原始文库进行扩
增，扩增后的文库滴度为 2.968×109 pfu·mL-1。
随机挑取18个单菌落进行PCR扩增鉴定，估
计文库的重组率和插入片段大小。电泳结果(图 4)
显示，插入片段大小在 0.5~2 kb，平均长度约
0.85 kb，没有空载体，重组率接近 100%。
讨　　论
文库的滴度、重组率及插入片段的大小是鉴
定 cDNA文库质量的指标。一般文库的滴度能达
到 10 5 p fu · mL- 1 以上为有效的文库(李太武等
图 2 红果人参叶中 ds cDNA的琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.2 Agarose gel electrophoretogram of ds cDNA
from P. ginseng cv. Hongguo
1：双链 c D N A；M：D L 2 0 0 0 D N A 分子量。
图 4 红果人参 cDNA文库插入片段的 PCR检测
Fig.4 PCR detection of inserted size from P. ginseng cv. Hongguo cDNA library
1 ~ 1 6：c D N A 插入片段；M：D L2 0 0 0 D N A 分子量。
图 3 红果人参叶中 ds cDNA过柱分级分离电泳图谱
Fig.3 Agarose gel electrophoretogram of ds cDNA from P. ginseng cv. Hongguo after fractionation
1 ~1 8：过柱后的 ds cD N A；M：D L2 0 0 0 D N A 分子量。
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月668
1998)。本文所获得的红果人参叶片中 cDNA原始
文库滴度为 1.008×106 pfu·mL-1，扩增后的文库滴
度为 2.968×109 pfu·mL-1，文库随机抽样 PCR检测
结果表明已成功构建了人参叶片 cDNA文库，文
库质量符合优良文库的标准(Sambrook等 1989)，
可以满足下一步的实验要求。据此认为，用所构
建的文库中筛选低丰度的目的基因在理论上是可行
的。
RNA的质量和 cDNA的完整性和代表性是影
响 cDNA文库的重要因素。本文采用 Clontech公
司的CreatorTM SMARTTM cDNA文库构建试剂盒和
SMART技术构建红果人参叶中 cDNA文库。在提
取高质量总RNA的前提下，不经过mRNA的纯化
过程，直接用总 RNA建库，可减少mRNA的降
解和损失，mRNA最大限度地转化为 cDNA，从
而有效地保证 cDNA的完整性。如果RNA链过长
或者存在复杂的二级结构，反转录酶往往会提前
终止反转录，不能获得足够的 cDNA全长，以致
文库质量下降。因此，在合成 cDNA第一链之前
应对 RNA进行 72 ℃ 2 min的热变性处理，并且
于冰浴中2 min后再进行cDNA合成。采用SMART
技术建库，不需要甲基化、接头平端等烦琐操
作，建库程序简单。用 LD-PCR对 ds cDNA进
行扩增，低丰度的基因在文库中可以得到富集，
从而便于稀有mRNA的扩增和克隆，保证文库的
代表性。
在构建 cDNA文库过程中，分级分离去除小
于 500 bp的 cDNA片段很重要。如果小片段不能
有效的去除，会与载体优先连接，造成插入片段
的平均长度过短，则文库的应用价值降低。但过
多的筛除 cDNA片段，势必造成原始文库的滴度
降低，影响文库的质量。本文合并了 8~11管的
cDNA 样品，收到良好的效果。
文库插入片段的检测，一般采用酶切法和
PCR鉴定的方法(王玉成等 2004)。酶切法通过用
内切酶将插入片段从载体上切下来，电泳检测切
片段的大小，这种方法需要较多的载体，要求载
体纯度高，又费时，优点是酶切片段直接反应插
入片段的长度。PCR鉴定法可以克服酶切法的缺
点，可一次对大量的克隆的进行鉴定，其缺点是
PCR产物长度略高于插入片段的长度。
参考文献
黄璐琳, 胡尚钦, 杨晓(2006). 药用植物生物工程研究进展 II. 分
子标记、遗传转化及功能基因研究 . 中草药 , 3 7 ( 5 ) :
647~651
李太武, 相建海, 刘瑞玉(1998). 中国对虾 cDNA文库的构建. 动
物学报, 44 (2): 237~238
王玉成, 杨传平, 刘桂丰, 姜静(2004). 紫杆柽柳 cDNA文库构建
与硫氧还蛋白基因的克隆. 分子植物育种, 2 (5): 667~673
Galaud JP, Carriere M, Pauly N, Canut H, Chalon P, Caput D,
Pont-Lezica RF (1999). Construction of two ordered cDNA
libraries enriched in genes encoding plasmalemma and tono-
plast proteins from a high-efficiency expression library. Plant
J, 17 (1): 111~118
Peterson LA, Brown MR, Carlisle AJ, Kohn EC, Liotta LA,
Emmert-Buck MR, Krizman DB (1998). An improved
method for construction of directionally cloned cDNA li-
braries from microdissected cells. Cancer Res, 58 (23):
5326~5328
Sambrook J, Maniatis T, Fristch EF (1989). Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2nd ed. NewYork: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 283~356