全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 3期，2004 年 6 月 353
PCR 快速分析水稻cDNA 文库构建质量方法的简化
向太和*
杭州师范学院生命科学学院，杭州 310036
Simplification of a PCR Method for Analysis the Condition of Rice cDNA Library
XIANG Tai-He*
School of Life Sciences, Hangzhou Normal College, Hangzhou 310036
提要 对由水稻 cDNA 文库铺成平板的噬菌斑，采用 tip 吸头穿刺噬菌斑后在 PCR 反应混合液中吸打 2 次，直接作为 PCR
扩增模板进行 PCR 反应和电泳分析的方法，可以达到快速、简便地分析水稻 cDNA 文库构建的质量。此法无需提取噬
菌斑 DNA 作为 PCR 扩增模板，操作简单、方便、快捷。
关键词 PCR；cDNA 文库；质量；方法；水稻
收稿 2003-10-08 修定 　 2003-12-05
资助　 杭州师范学院科研启动基金 (87)。
*E-mail:xth0101@sina.com, Tel:0571-88804115
构建 cDNA 文库是图位克隆基因的关键性步
骤之一，构建的 cDNA 文库质量直接关系到能否
获得完整或较大的基因片段[1]，因此，对获得的
cDNA 文库需进行构建质量即插入噬菌体载体中
cDNA 片段大小的分析检测。通常的方法是将构
建的文库铺成平板形成单个噬菌斑后挖取噬菌斑，
加入氯仿和特定的缓冲液让噬菌斑 DNA 释放，再
感染宿主菌繁殖噬菌体，最后提取噬菌体 DNA 用
于 PCR 扩增反应或者酶切鉴定插入的 cDNA 片段
大小[ 2 ]。此种鉴定程序较为复杂。我们在水稻
cDNA 文库的构建中，采用了一种快速分析 cDNA
文库构建质量的简单方法，现介绍如下。
材料与方法
水稻(Oryza sativa)品种农林8号cDNA文库由
安徽省农业科学院生物技术室用Stratagene公司的
ZAP cDNA 试剂盒构建完成。依据 ZAP 载体两端
含有T3 和 T7 启动子序列[3]设计 PCR引物。引物序
列是 P1：5 ＇AATTAACCCTCACTAAAGGG 3 ＇，
P2：5 ＇ TAATACGACTCACTATAGG 3 ＇。PCR
反应体积是35 mL，其中含有3.5 mL 10× 反应缓
冲液、2 mL dNTP(2 mmol·L-1，美国 Promega 公
司)、 P1 和 P2 引物(1 pmol·mL-1，上海 Sangon公
司合成)各2 mL 、1 mL Taq DNA聚合酶(2 U·mL-1，
美国 Promega公司)。方法1是我们采用的简易方
法，即每 35 mL PCR 反应体积中加入 24.5 mL
ddH2O，用 20 mL tip 吸头刺穿单个噬菌斑后在
PC R 反应混合液中吸打 2 次，以此作为 DN A 模
板。方法 2 是通常采用的方法，每35 mL 反应体
积中加ddH2O 23.5 mL，按照Stratagene 公司的操
作指南提取单个噬菌斑的 DNA，取 1 mL(约 100
ng·mL-1)作为 DNA 模板。PCR 反应程序为 94℃变
性 5 min后，按照94℃ 45 s、58℃ 45 s、72℃
90 s 进行 35 个循环，循环结束后在 72℃延伸 5
min。扩增产物在1.4%琼脂糖凝胶上电泳1.5~2 h
(5 V·cm-1)，以100 bp ladder plus(美国Promega公
司)作为 DNA 分子量标记，溴化乙锭染色，紫外
光下观察，用凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)观
察和拍照记录。
结果与讨论
随机选取铺成的噬菌斑平板，噬菌斑的密度
为直径10 cm的培养皿中含有2 500~3 000个噬菌
斑。图1中上图是用方法1对随机选取的20个噬
菌斑扩增的结果，下图是用方法 2 对随机选取的
10 个噬菌斑扩增的结果。可以看出方法1同样可
以获得较清晰的 PCR 扩增结果。这是因为 PCR 反
应十分灵敏，即使DNA模板含量少至1~2 pg，从
理论上讲甚至 1 个 DNA 分子也可通过 PCR 反应扩
增出特征性条带[4]，而方法1用tip吸头穿刺噬菌
技术与方法Techniques and Methods
植物生理学通讯 第 40 卷 第 3期，2004 年 6 月354
斑后在 PCR 反应液中吸打 2 次，PCR 反应液中已
含有足够量的DNA 分子满足PCR 扩增反应。通过
扩增结果可以看出，构建的cDNA 插入片段大小在
400~2 000 bp之间均匀分布，构建的质量较好。
方法 1 的最大优点在于无需提取噬菌斑
D N A ，操作简单、快速，节约试剂和材料。根
据我们的操作经验，采用方法 1 时还应注意如下
两点：(1)tip吸头选用20 mL较好，tip吸头太大，
刺吸噬菌斑时易带上培养基；同时使用 20 mL 微
量进样器，并将20 mL微量进样器调至5 mL加样
刻度，加样器刻度调得太小吸打时无力，太大则
易产生泡沫。(2)若铺成的噬菌斑平板培养基较厚
时，不要穿透培养基，仅需刺穿噬菌斑即可，以
免tip吸头带上培养基。
值得一提的是，我们曾设计需要筛选的特定
基因的两端引物，试图利用这种简易方法，从
cDNA 文库中直接筛选目的基因，但需要筛选的
噬菌斑数量太多，即每一个噬菌斑都需要进行一
次 P C R 反应，工作量极大。不过，根据这种方
法，若设计机械化的均匀铺噬菌斑平板的设备，
再用机械手臂均匀穿刺噬菌斑进行 PCR 反应，就
可达到快速、简易地筛选 cDNA 文库的目的。另
一方面，在 cDNA 文库的筛选中，当通过原位分
子杂交筛选到阳性克隆时，通常需提取阳性克隆
噬菌斑，重新铺平板再进行第二次原位分子杂
交。而用这一方法完全可以省略第二次原位杂
交，无需提取噬菌体重新铺平板，可针对筛选到
的阳性克隆噬菌斑，进行一次 P C R 扩增就可快
速、简便地对阳性克隆斑进行验证。此外，该
方法对于分析构建的基因组文库如 BAC 库、YAC
库和 TA C 库等的质量可能也有效。
参考文献
1 Bethards LA, Skadsen RW, Scandalios JG. Isolation and char-
acterization of a cDNA clone for the gene in maize and its ho-
mology with other catalases. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84
(19): 6830~6834
2 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning: A labo-
ratory manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Press,
1989
3 Short JM, Fernandez JM, Sorge JA et al. Lambda ZAP: a bacte-
riophage lambda expression vector with in vivo excision
properties. Nucleic Acids Res, 1988, 16(15):7583~7600
4 胡稳奇, 张志先. PCR技术在环境微生物检测中的应用. 环境
科学, 1994, 15(4): 80~83
图1 两种方法对水稻cDNA文库噬菌斑扩增结果的比较
M: 100 bp ladder plus DNA 分子量标记；方法1中1~20、
方法 2中 1~10: 单个噬菌斑 PCR 扩增条带。