全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月 897
亚麻中雄性不育基因同源序列MS2-F的克隆和表达分析
斯钦巴特尔 1,2, 张辉 2,*, 哈斯阿古拉 1, 贾霄云 2, 高凤云 2
1内蒙古大学生命科学学院, 呼和浩特 010021; 2内蒙古农牧业科学院亚麻课题组, 呼和浩特 010031
提要: 用同源序列克隆法从亚麻中克隆了雄性不育基因同源序列MS2-F cDNA (登陆号: EU363493)。该 cDNA全长 1 911
bp, 包含一个 1 608 bp的ORF, 编码 535个氨基酸。推导的蛋白质序列中包含 2个雄性不育保守区: NAD结合区域和雄性
不育C-末端区域。该基因与油菜和拟南芥雄性不育基因的一致性分别为59.65%和59.16%, 为花蕾特异表达基因, 推测在
亚麻花粉发育过程中与脂酰辅酶 A还原酶有相似功能。MS2-F cDNA对应的 gDNA大小为 2 696 bp (登陆号: EU365361),
含有 8个内含子和 9个外显子。
关键词: 亚麻; 雄性不育同源序列MS2-F; 克隆
Cloning and Expression Analysis of Male Sterility Gene Homology Sequence
MS2-F in Flax
SIQIN Bateer1,2, ZHANG Hui2,*, HASI Agula1, JIA Xiao-Yun2, GAO Feng-Yun2
1College of Life Sciences, Inner Mongolia University, Huhhot 010021, China; 2Research Group of Flax, Inner Mongolia Academy
of Agricultural and Husbandry Science, Huhhot 010031, China
Abstract: A cDNA, homologous to MS2 in Arabidopsis thaliana, named MS2-F (GenBank accession No.:
EU363493), was cloned from flower buds of flax by Homology-based cloning method. The complete cDNA
sequence was 1 911 bp and contained an ORF of 1 608 bp, which encoded a protein of 535 amino acids
including two male sterile conserved domains: NAD-binding domain and male sterile C-terminal domain. MS2-
F amino acid sequence identities to MS2Bnap in Brassica napus and MS2 in Arabidopsis thaliana were 59.65%
and 59.16% respectively. The gene was exclusively expressed in flower buds and may act as an acyl CoA
reductase during flax pollen development. Genomic DNA fragment of the gene was 2 696 bp (GenBank acces-
sion No.: EU365361) and contained 8 introns and 9 exons.
Key words: flax; male sterility homologous gene MS2-F; clone
收稿 2008-06-11 修定 2008-08-11
资助 国家自然科学基金(30460069)和内蒙古自治区自然科学
基金(2 00 50 801 03 01 )。
* 通讯作者(E-mail: zhanghui2345@126.com; Tel: 0471-
5 9 0 2 7 5 0 )。
植物花药的发育过程中, 约有 20 000个基因
在花药中表达(Kamalay和Goldberg 1980), 但其中
仅有 10%~20%的基因是花药特异表达(Willing和
Mascarenhas 1984; Willing等 1988), 只要有任何一
个基因发生突变, 都有可能导致植物雄性不育的发
生。迄今已分离鉴定的花粉发育特异基因只有几
十种, 主要在拟南芥、烟草、水稻、玉米、油
菜和矮牵牛等植物中得到克隆(刘乐承等 2006)。
亚麻是我国北方地区重要的油料作物和纤维
作物。它含有的α-亚麻酸的保健和医药功能也不
断得到开发。但由于亚麻是自花授粉作物, 其遗传
变异的扩大和杂种优势的利用受到限制。因此, 亚
麻花药、花粉发育过程中有关基因及其启动子的
克隆研究可对获得基因工程亚麻雄性不育系及亚麻
杂种优势的利用奠定基础。本文用同源序列克隆
法, 从亚麻花蕾中克隆出与拟南芥雄性不育基因 -
MS2同源的亚麻MS2-F基因并对其进行了序列和
表达分析。
材料与方法
由显性核不育亚麻(Linum usitatissimum L.)不
育系分离出的雄性可育亚麻和雄性不育亚麻(H919)
为材料。将杂种 F1代亚麻种子播种, 在开花期根
据标记性状辨别可育株和不育株(陈鸿山 1986)。
根据大小(张辉等1993)采集处于减数分裂前期的小
可育花蕾、根、茎、叶, 放在液氮中快速冷冻后
置于-70 ℃超低温冰箱中保存。
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TRNzol总 RNA提取试剂盒、Quant反转录
酶、TIANgel Midi普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂
盒、pGM-T连接试剂盒和大肠杆菌 Top10感受态
细胞均购自 TIANGEN公司。5/3 RACE Kit, 2nd
Generation购自 Roche公司。
总RNA的提取和cDNA第一链的合成均按照
TRNzol总RNA提取试剂盒及Quant反转录酶说明
书进行。
根据文献中的拟南芥雄性不育基因MS2 (Aarts
等 1993)、油菜MS2Bnap cDNA (Hodge等 1992)、
水稻推测雄性不育基因以及小麦中分离的MS2同
源基因的氨基酸序列(陈军方等2005), 以多序列比
对软件 Block Maker分析, 得出它们无间断的氨基
酸序列保守区(Blocks)。然后用 CodeHop软件
(Consensus Degenerate Hybrid Oligonucleotide
Primers)针对这些保守区设计出多条CODEHOP简
并引物(Rose 1998; Richmond 2000), 从中选 2对,
序列为, 第1对是P1: 5 GGATACTTACGTTTTCAC-
Taargcnatggg 3; P2: 5 TCCATCATTCTGTTTccytc-
catcca 3; 第2对是P3: 5 GATCCTTTCCCTGGAtg-
gatggargg 3; P4: 5 GCCAGAGTAGCGTTAACAac-
catrtcngc 3。RT-PCR反应体系为 25 µL,含有 2.5
µL 10×Buffer, 3.0 µL dNTPs (2.5 mmol·L-1), 4.0 µL
正向和反向引物, 2.0 µL cDNA, 2.5 U Taq酶, 补充
灭菌超纯水至 25 µL。扩增条件为: 95 ℃ 5 min; 94
℃ 30 s, 57 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 25个循环; 70 ℃ 10
min。扩增产物以 1.5%琼脂糖凝胶电泳分离。预
期目的片段的回收、连接和转化采用 TIAN gel
Midi Purification Kit、pGM-T连接试剂盒及大肠杆
菌 Top10感受态细胞。随机挑选 3个独立阳性克
隆, 送上海生工生物工程公司测序。
根据已获得的基因 cDNA片段序列, 设计2条
3 RACE基因特异引物SP5和SP6, 序列为, SP5: 5
CCTGTTGTCATTCTCAGACCG 3 ; SP6: 5
TGGAAGGCAACAGGATGATG 3。基因3末端第
一链 cDNA的合成反应体系为 20 µL,含有 4 µL
cDNA合成缓冲液, 2 µL dNTP混合物, 1 µL Oligo
dT-锚定引物, 1.5 µL总RNA (1 µg·µL-1), 1 µL反转
录酶和 10.5 µL无 RNA酶水。反应条件为: 55 ℃
保温 60 min, 85 ℃保温 5 min。
以 3末端第一链 cDNA为模板, 用 PCR锚定
引物和 SP5进行第 1次 PCR扩增, 扩增条件为: 95
℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 25个循
环; 70 ℃ 10 min。以第 1次 PCR产物为模板, 利
用 PCR锚定引物和 SP6进行第 2次 PCR扩增, 扩
增条件为: 95 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃
40 s, 25个循环; 70 ℃ 10 min。第 2次扩增产物经
1.2%琼脂糖凝胶电泳分离后, 回收目的片段, 连接
转化, 检测后测序。
根据已获得的基因 cDNA片段序列, 设计3条
5RACE基因特异引物 SP1、SP2和 SP3, 序列为,
SP1: 5 CACGTCAAGAACACCATTTGG 3; SP2: 5
G CTCTC AATC ACACTC GG T 3 ; S P 3: 5
CAACAGGAATCTCGCCTCTC 3。基因 5末端第
一链 cDNA的合成反应体系为 20 µL, 含有 4 µL
cDNA合成缓冲液, 2 µL dNTP混合物, 1 µL SP1, 1.5
µL总RNA (1 µg·µL-1), 1 µL反转录酶和 10.5 µL无
RNA酶水。反应条件为: 55 ℃保温 60 min, 85 ℃
保温 5 min。以 5末端第一链 cDNA为模板, 利用
PCR锚定引物和SP2进行第1次PCR扩增, 扩增条
件为: 95 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s,
25个循环; 70 ℃ 10 min。以第 1次 PCR产物为
模板, 利用PCR锚定引物和SP3进行第二次PCR扩
增, 扩增条件为: 95 ℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s,
72 ℃ 40 s, 25个循环; 70 ℃ 10 min。第 2次扩增
产物经 1.2%琼脂糖凝胶电泳分离后, 回收目的片
段, 然后克隆测序。
将获得的基因 cDNA 5末端、保守区域及和
3末端cDNA碱基序列拼接后得到基因cDNA全长
序列。根据该序列设计一对基因特异引物GSP1:
5 TGGGAGAACATCAGCATTGGT 3和GSP2: 5
TTGTTACAATCCCAGTAGTAGA 3。以花蕾总
RNA为模板, 进行反转录, 用GSP1和GSP2进行
RT-PCR, 扩增基因 cDNA序列。同时, 以亚麻总
DNA为模板, 用GSP1和GSP2进行 PCR, 扩增其
对应的基因组DNA (gDNA)。PCR反应条件: 95
℃ 5 min; 94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min, 25个
循环; 70 ℃ 10 min。扩增产物经 1.0%琼脂糖凝
胶电泳, 回收目的片段, 然后克隆测序。
基因序列分析用NCBI中的ORF finder软件进
行阅读框架的识别。用蛋白质结构功能域分析网
站 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/
wrpsb.cgi进行蛋白质功能域的分析, 并用蛋白质序
列比对(http://www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
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进行氨基酸序列同源性分析。
基因的Northern杂交表达分析时, 从亚麻根、
茎、叶和花蕾中分别提取总 RNA, 进行含甲醛的
1.3%变性琼脂糖凝胶电泳, 用印迹转移法将 RNA
转移到尼龙膜上。RNA的电泳和转膜主要参照萨
姆布鲁克等(2002)书中第七章第二节(二)、(四)方
法进行。探针标记、杂交及免疫检测均按照DIG-
High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I
的说明书要求进行。以基因 cDNA为探针。以18S
rDNA为阳性对照。
结果与讨论
1 基因保守序列片段的获得
根据文献报道的拟南芥、油菜、水稻和小麦
中的雄性不育基因氨基酸保守序列, 用网络软件设
计合成 2对 CODEHOP简并引物。以亚麻花蕾总
RNA为模板, 经过 RT-PCR, 2对引物均获得扩增
产物, 测序的结果表明, 2个片断均为 150 bp。经
拼接后获得了259 bp的保守区片段, 符合预期大小
(图 1 )。
cDNA序列设计一对基因特异引物, 进行基因的扩
增。以亚麻花蕾总 RNA为模板, 经 RT-PCR扩增,
得到大小约为 1 700 bp的 cDNA, 该 cDNA序列与
经拼接获得的全长cDNA序列完全一致; 以亚麻基
因组 DNA为模板, 经 PCR扩增, 得到大小约为
2 700 bp的基因组DNA片段(gDNA) (图 3)。
图 1 MS2-F基因片段的RT-PCR结果
Fig.1 The result of RT-PCR of MS2-F gene fragment
M: DL2000; 1: 第 1对引物的产物; 2 : 第 2对引物的产物。
2 MS2-F基因全长序列的获得
以获得的 259 bp的 cDNA序列为基础, 用
RACE技术, 得到MS2-F基因的5末端和3末端的
cDNA序列, 分别为 975 bp和 869 bp (图 2)。5末
端、保守区域和 3末端序列拼接后得到一个 1 911
bp大小的 cDNA全长序列。
为了验证拼接所获得的基因 cDNA序列的正
确性和研究基因的结构, 根据拼接得到的 1 911 bp
图 2 MS2-F基因的 5 RACE 和 3 RACE扩增
Fig.2 Amplified products of MS2-F by 5 RACE and 3 RACE
M: DL2000; 1: 3 RACE; 2: 5 RACE。
3 MS2-F序列分析
经测序, MS2-F cDNA序列的确切长度为1 709
bp, 含有 1 608 bp的开放阅读框(ORF), 编码 535个
氨基酸; 其对应的基因组 DNA长度为 2 696 bp。
将基因组DNA和 cDNA序列比对的结果表明, 该
基因由 9个外显子和 8个内含子组成。从第 1个内
含子到第 8 个内含子的大小分别为: 385、75、
76、75、70、89、131和 89 bp, 共计 990 bp。
图 3 MS2-F基因 cDNA 全长和DNA全长的扩增
Fig.3 PCR products of full cDNA and DNA of MS2-F
M: λDNA/HindIII/EcoRI; 1: MS2-F gDNA; 2: MS2-F cDNA。
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月900
每一个内含子两端均有典型的GT/AG结构(图 4)。
该基因序列已在GenBank中成功注册, 其登陆号分
别为: EU363493和EU365361。在蛋白质结构功能
域分析网站 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/
cdd/wrpsb.cgi 进行保守结构功能域的分析发现, 该
基因含有2个雄性不育保守区: 第1个是从第52到
第354个氨基酸, 叫NAD结合区; 第2个是从第468
到第 526个氨基酸, 叫雄性不育 C-末端区(图 5、
6 )。
蛋白质氨基酸序列同源性比较的结果表明, 该
基因与许多植物雄性不育基因或雄性不育相关基因
具有同源性, 其中与油菜雄性不育基因MS2Bnap
(GenBank登录号: ABO14927)和拟南芥MS2 (MALE
STERILITY2) (GenBank登录号: CAA52019)的一致
性最高, 分别为 59.65%和 59.16%。其第 1个保守
区与油菜MS2Bnap、拟南芥MS2对应的第 1保守
区的一致性分别为74.57%和72.7%; 而其第2个保
守区与油菜MS2Bnap、拟南芥MS2对应的第 2保
守区的同源性分别为 83.05%和 84.75%。除与这
2个基因具有同源性外, 还与加州希蒙得木脂酰辅
图 4 亚麻MS2-F基因全序列
Fig.4 Full length sequence of flax MS2-F gene
阴影部分为外显子, 下划线字母为内含子两端典型的 GT/AG 结构。
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图 5 亚麻MS2-F蛋白的氨基酸序列
Fig.5 The amino acid sequence of flax MS2-F protein
阴影部分为雄性不育蛋白功能结构保守区。
酶 A 还原酶基因 J J F A R ( G e n B a n k 登录号:
A A D 3 8 0 3 9 )、水稻脂酰辅酶 A 还原酶基因
(GenBank登录号: BAD31814)和小麦脂酰辅酶A还
原酶基因(GenBank登录号: CAD30696)具有很高的
同源性。其第一个保守区与它们对应的保守区具
有 44.01%、44.55%和 44.92%的一致性。总之,
根据序列分析结果推测, 本文中克隆的基因为雄性
不育基因同源序列, 其功能很可能具有脂酰辅酶A
还原酶的作用。
4 亚麻MS2-F基因在不同组织中的表达分析
为了深入研究亚麻MS2-F基因的表达特性, 以
亚麻根、茎、叶和花蕾总 RNA为模板, MS2-F
cDNA为探针, 进行Northern印迹杂交的结果表明,
探针只与花蕾总 RNA有杂交信号, 而与根、茎和
叶的总 RNA没有杂交信号。这表明, 本文所获得
的亚麻雄性不育相关基因只在亚麻花蕾中特异表
达, 可能在亚麻花粉发育过程中起作用(图 7)。
总之, 本文中分离的亚麻雄性不育相关基因是
通过同源序列克隆法获得的。同源序列分析结果
显示, 该基因除与拟南芥MS2基因和油菜MS2Bnap
cDNA等雄性不育基因具有最高的同源性外, 还和
小麦、水稻以及好好霸(JoJoba)树中分离的脂肪酰
辅酶A还原酶基因也有很高的同源性。Northern
图 6 亚麻MS2-F蛋白的功能结构域分析
Fig.6 The conserved domains of MS2-F protein
该蛋白含有 2个雄性不育保守区域: NAD 结合区和雄性不
育 C - 末端区。
图 7 不同器官中MS2-F的Northern 杂交表达分析
Fig.7 Northern hybridization expression analysis of MS2-F
in different organs
a: 总 RNA琼脂糖凝胶电泳; b: 阳性对照, 以 18S rDNA为探
针; c: 以MS2-F cDNA为探针。1: 花蕾; 2: 根; 3 : 茎; 4 : 叶。
杂交结果表明, 该基因只在花蕾中特异表达。因此
可以推测本文所分离得到的基因为雄性不育基因同
源序列, 具有与脂肪酰辅酶A还原酶基因相似的功
能。可能参与小孢子壁孢粉素的形成过程中(Aarts
等 1997; Shockey 1995)。但是该雄性不育同源序
列在亚麻花药、花粉发育过程中的时空表达及功
能尚需深入研究。
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