全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第6期，2006年12月 1063
收稿 2006-07-11 修定 　2006-11-09
资助 上海市科技兴农重点攻关项目[沪农科攻字(2005)第1-6号]。
致谢 浙江林业大学应雪宜先生提供部分试验材料。
*通讯作者(E-mail: lzc@sagc.org.cn, lijun@sagc.org.cn;
Tel: 021-52230526; Fax: 021-62204010)。
红花石蒜茎尖的玻璃化超低温保存
林田1 刘灶长1,* 李天菲1 李锡香2 罗利军1,*
1 上海市农业生物基因中心，上海 201106；2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081
提要 2~3 mm 的石蒜茎尖放在 MS+0.4 mol·L-1 蔗糖的培养基上预培养 5 d，在 25℃下用预处理液处理 20 min，接着用冰浴
的玻璃化保护剂 PVS2 在冰浴中处理 80 min 后，换新鲜 PVS2 并迅速投入液氮。液氮保存 24 h 后，于 40℃水浴中快速解
冻 2 min，用 MS+1.2 mol·L-1 蔗糖的液体培养基洗涤 20 min，滤纸吸干后接种到恢复培养基中，在 25℃下暗培养 7 d 后，
转入光照强度为 36 µmol·m-2·s-1 和光暗周期 12/12 h 条件下培养。2 周后的成活率最高可达 90%，植株再生率达 53%。
关键词 红花石蒜；茎尖培养；玻璃化法；超低温保存
Study on Cryopreservation of Shoot Tips of Lycoris radiata Herb by Vitrifica-
tion in vitro
LIN Tian1, LIU Zao-Chang1,*, LI Tian-Fei1, LI Xi-Xiang2, LUO Li-Jun1,*
1Shanghai Agrobiological Gene Center, Shanghai 201106, China; 2Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of
Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract An efficient cryopreservation procedure by vitrification was developed for long-term conservation of
shoot tips of Lycoris radiata Herb in vitro. The procedure included 4 steps: at first, the shoot tips, 2-3 mm in
length, were pre-cultured on MS medium enriched with 0.4 mol·L-1 sucrose for 5 d; and second, pre-cultured
shoot tips were treated for 20 min with a loading solution at 25℃; and then they were subjected to ice-cooled
vitrification solution for 80 min and transferred to 2 mL cryotubes with fresh vitrification solution (PVS2) and
plunged into liquid nitrogen; at last rapid thawing took place in 40℃ water bath for 2 min followed by the deloading
step for 20 min in a deloading solution consisted of 1.2 mol·L-1 sucrose liquid MS medium. Further recovery and
growth took place on regeneration medium in the dark at 25℃ for 7 d and then with 36 µmol·m-2·s-1 irradiance
and light/dark cycle of 12/12 h. The highest survival rates of the shoot tips reached 90% after 2 weeks incuba-
tion and the regeneration rate reached 53%.
Key words Lycoris radiata Herb; in vitro-grown shoot tips; vitrification; cryopreservation
对于难以获得种子而以营养器官繁殖的植
物，一般通过繁种圃或保存圃的田间种植方式保
存其资源。这种保存方法不仅占用耕地、耗时、
费力，还存在受干旱、洪涝、低温、热害和病
虫害等自然灾害的影响而导致种质变异或种质毁灭
的危险性，不宜于长期保存。超低温保存是指在
液氮(-196℃)下的低温保存。在此条件下，植物
的生理生化活动几近停止，贮藏过程中的生理代
谢活动和遗传变化能够控制在最低限度内，具有
长期和稳定保存的优点，作为遗传资源的长期保
存方法，超低温保存技术被认为是克服上述问题
的最佳选择(Engelmann 1997)。超低温保存有多种
方法，而近年发展起来的玻璃化法，因其简易有
效，已广泛用于十几种植物的种子、茎尖、胚
性细胞的保存(Sakai和Nishiyama 1978；Niino和
Sakai 1992；Reed 1993；Engelmann 2004；Wang
等2005)。但迄今针对石蒜(Lycoris)的超低温保存
技术尚未确立。为此，本文采用玻璃化法对红花
石蒜(Lycoris radiata Herb)茎尖的超低温保存技术
进行了探索，现报道如下。
材料与方法
取红花石蒜(Lycoris radiata Herb)的3~4年生
鳞茎，用70% 酒精消毒1 min，0.1% 的升汞消毒
15 min，无菌水冲洗若干次后，将带3~4 层鳞片
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及部分茎盘的鳞茎切块(约 1 cm 大小)接种于含 3
mg·L-1 6-BA 及 0.5 mg·L-1 NAA 的 MS 培养基上诱
导小鳞茎。培养温度为(25±2)℃，光照12 h·d-1，
光照强度36 µmol·m-2·s-1。
作预培养、玻璃化处理及冻存保存时，取继
代培养20~30 d 的小鳞茎(图 4-a)，切取 1~5 mm
不同大小的茎尖，接种到含0.3~0.7 mol·L-1蔗糖
的 MS 培养基内，25℃下暗培养 3~7 d。将预培
养后的茎尖放在预处理溶液(Matsumoto 等 1994)
中，于室温下处理 20 min 后，转入玻璃化保护
剂PVS2 (Sakai等 1990)中进行30~150 min的冰浴
处理，再将茎尖转移至装有预冷过的新鲜PVS2的
2 mL冷冻管中(10个茎尖 ·管-1)，迅速投入液氮中
保存。
解冻和恢复培养时，从液氮中取出冻存24 h
以上的冷冻管，立即放入 40℃水浴中快速解冻 2
min。茎尖在室温下用含1.2 mol·L-1 蔗糖的MS培
养液洗涤2~3次，每次5~10 min。洗涤后的茎尖
用滤纸吸干后，转移至含 0.5 mg·L-1 6-BA+0.1
mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 GA3 的 MS 半固体培养基中
暗培养7 d，再转入含3 mg·L-1 6-BA和 0.5 mg·L-1
N AA 的 MS 固体培养基中，在同小鳞茎诱导的条
件下培养，2周后计算成活率。已恢复生长(萌发
根、芽或愈伤组织)的茎尖视为成活。成活茎尖
数占整个处理茎尖数的百分率为成活率。每个处
理有20个茎尖，重复3次。实验于2004~2006年
在上海市农业生物基因中心进行。
实验结果
1 茎尖长度对超低温保存茎尖成活率的影响
超低温保存中，石蒜茎尖长度对超低温保存
的成活率及恢复培养均有影响。材料体积小，在
冻存中容易脱水，受冰晶伤害小，但在其后的恢
复生长中不易成活，所以选用体积大小适当和成
活率较高的茎尖，是应注意的问题。据报道，冻
存中的百合茎尖长度，以2~3 mm 为最佳(张玉芹
等 2004)。而在本文中，用长度<2、2~3 和 4~5
mm 的茎尖在蔗糖浓度为0.4 mol·L-1 的 MS 培养基
内预培养3 d后，用预处理液处理20 min，再以
PVS2处理 80 min，冻存后恢复培养其结果表明：
茎尖为2~3 mm的成活率最高(可达 80%)。茎尖小
于 2 mm 或大于 4 mm 的成活率仅为 40% 和 33%
(图 1)。这可能是由于石蒜茎尖外层鳞片包裹紧
密，保护剂渗入受阻，以及茎尖过大不利于保护
剂和恢复培养时营养物质的渗入，以致成活率
低；但茎尖过小，裸露的生长点直接接触高浓度
的保护剂，可能会引起伤害，因而成活率下降。
图1 茎尖长度对茎尖成活率的影响
Fig.1 Effect of shoot tip length on survival rate in vitro
不同字母表示在 p<0.05 水平具显著差异。图 2~3 同此。
2 蔗糖浓度及预培养时间对茎尖成活率的影响
茎尖的生理状态对冻后成活率有显著影响。
通过较长时期的继代培养和短期的高浓度蔗糖预培
养后，组织可缓和地脱去部分水分，促使细胞分
泌保护物质，从而有利于冻后存活。对此，一
般是切取较大茎尖组织经预培养后，再切取适当
大小的组织进行超低温保存。但由于石蒜茎尖外
鳞片包裹紧密，经高浓度的蔗糖预培养后，茎尖
组织会变软，水渍化，这给之后的剥取操作造成
很大不便。茎尖极易受到损伤，而且在其后的恢
复培养中只能形成愈伤组织，分化比较困难。本
实验先在解剖镜下仔细逐层剥去茎尖的鳞片，并
切成适当大小组织块，经预培养后直接进行玻璃
化处理。取 2~3 mm 的茎尖放在蔗糖浓度分别为
0.3、0.4、0.5和 0.7 mol·L-1的 MS培养基上预培
养3 d，再用预处理液处理20 min，并以PVS2处
理 80 min。其冻后24 h进行恢复培养结果显示：
含0.4 mol·L-1蔗糖的培养基成活率最高，可达80%
(图 2); 含 0.5 mol·L-1 蔗糖的培养基次之，为
64%；若蔗糖浓度高于 0.7 mol·L-1，茎尖在预培
养时容易褐变，解冻后茎尖明显变软且呈水渍
状，成活率降至 21%。这可能是高渗透压对组织
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造成伤害的结果。
从最佳预培养时间来说，茎尖在0.4 mol·L-1
蔗糖的 MS 培养基上分别预培养 1、3、5 和 7 d
后，再冷冻保存和恢复培养的结果显示：预培养
时间 1 d 的成活率仅为 18%。预培养 3 和 5 d 的
效果较好，成活率分别可达 80 % 及 9 0 %。预培
养时间长于7 d，则可能由于茎尖外围的鳞片过度
闭合，以致外植体不易玻璃化，所以其成活率仅
为 3 3 % 。　
3 PVS2处理时间对茎尖成活率的影响
经 PVS2 处理的组织会脱去水份，这样在冻
存中可进入玻璃化状态，从而有效地保护细胞活
性。但由于PVS2成份中含有毒性及导致变异的物
质，所以必需严格掌握，在保证有足够高的成活
率的前提下，尽量缩短处理时间。取 2~3 mm 的
石蒜茎尖放入蔗糖浓度为0.4 mol·L-1的MS培养基
上培养5 d后，用预处理液处理20 min并以预冷
过的PVS2分别处理30、60、80、120和 150 min。
恢复培养的结果表明：处理时间为30 min，由于
时间过短，材料脱水不够，不能成活；之后随
着处理时间的延长，成活率上升，80 min时最高
可达90%；但若延长至 150 min 时，成活率反而
降为20% (图 3)。
4 茎尖恢复培养与植株再生
茎尖解冻后接种在培养基上5~7 d 后，未成
活的茎尖发生褐变或漂白，而成活的茎尖则转成
淡黄至黄褐色(图4-b)。继续培养14~28 d后便恢
复生长，但最长需 40~60 d 才能在茎尖见到有芽
萌动，再生率可达 53%。茎尖恢复生长时会出现
3种情况：(1)直接在茎尖上长出苗；(2)从茎尖基
部长出根，但不能分化成苗；(3)茎尖形成愈伤组
织并膨大(图4-c)。后两种情况可能是茎尖剥取中
的机械损伤所致。在恢复培养中，根比芽更易再
生，且恢复生长较快，14 d 后根长可达 0.5~1
c m。这与在百合超低温保存中的结果一致，可
能是根对高渗透压保护剂的耐受性较强所致
(Bouman 等 2003)。我们还见到，带有根原基和
芽原基的茎尖也能在长根时萌芽，且恢复生长
快，约 2 个月的再生植株可长达 4 cm，植株强健
(图4-d)，这样的结果和冷冻前茎尖结构的完整性
有 关 。
讨　　论
石蒜为营养繁殖的球宿根植物，其组织含水
量较多，易结冰，所以其超低温保存难度较大。
本文成功进行了石蒜茎尖的超低温保存，并在解
冻和恢复培养后可以分化成再生植株，这对鳞茎
和球宿根类植物的超低温保存来说，具有一定的
参考价值。
茎尖的生理状态和完整性对其成活及再生的
影响至关重要。已有报道认为，大蒜超低温保存
时，将5~8 mm 的茎尖于含0.7 mol·L-1 蔗糖的培
养基上预培养7 d后，切取3~3.5 mm的茎尖作超
低温保存的成活率可达到最高(王艳军等 2005)。
Bouman 等(2003)在百合种质超低温保存中也指
出，预培养除了提高抗冻性外，还可促进切取过
程中伤口的修复，进而促进成活。本文结果进一
步表明，将仔细剥取后的石蒜茎尖预培养后直接
进行玻璃化处理，也可以得到较好的结果。此
外，我们还观察到，恢复生长时，带有根芽原
图2 预培养基中的蔗糖浓度对茎尖成活率的影响
Fig.2 Effect of sugar concentration in the
pre-culture medium on survival rate
图3 PVS2处理时间对茎尖成活率的影响
Fig.3 Effect of time in PVS2 on survival rate
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基的茎尖再生较快。据此可以推测，如能诱导出
胚状体，则由于其体积小、数量多，并有分化
再生成完整植株的能力，因而可能是超低温保存
的良好材料，这方面工作我们正在探索之中。
冻后植株成活的快速鉴定，一般采用 T T C
法，但也有研究指出，TTC 法检测的只是脱氢酶
的活性，并不能准确反映成活率的高低(王子成和
邓秀新 2001)。在本文的预备试验中，曾将未经
任何处理的茎尖直接投入液氮中，解冻后以 TTC
法检验的成活率达100%，但茎尖在其后的恢复培
养中均死亡。石蒜茎尖在恢复培养时，有的茎尖
需经 6~8 周才能萌动再生，且死亡的茎尖并不明
显发生褐变，因而造成成活率鉴定中的困难。在
我们的多次试验中，观察茎尖颜色变化也可在较
短时间(3~7 d)内判断茎尖的成活与否，这也可以
作为一种辅助方法使用。
参考文献
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图4 超低温保存阶段的茎尖状态与变化
Fig.4 Morphological status and change of shoot tips during cryopreservation
a：继代 20~30 d 的小鳞茎；b：冻后成活(中间的)与未成活茎尖(两侧的，可见颜色差异)；c：茎尖恢复培养的 3 种类型；
d：恢复培养 60 d 后的再生植株。