全 文 ：植物生理学通讯 第 41卷 第 1期，2005年 2月70
云南药用野生稻核基因组细菌人工染色体(BAC)文库的构建与分析
阿新祥1 吴成军2 鄢波2 程在全2 姚春馨2 黄兴奇2 陈善娜1,*
1 云南大学生命科学学院，昆明 650091；2 云南省农业科学院生物技术研究所，昆明 650223
Construction and Analysis of Genomic Bacterial Artificial Chromosome (BAC)
Library of Oryza officinalis in Yunnan
A Xin-Xiang1, WU Cheng-Jun2, YAN Bo2, CHENG Zai-Quan2, YAO Chun-Xin2, HUANG Xing-Qi2, CHEN Shan-Na1,*
1College of Life Sciences, Yunnan University, Kunming 650091; 2Biotechnology Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural
Sciences, Kunming 650223
提要 通过云南药用野生稻核基因组 BAC 文库的构建，保存处于濒危状态的云南药用野生稻遗传资源。该文库包含 27
500 个克隆，随机挑取 80 个克隆检测，插入片段平均大小为 80 kb，文库容量相当于水稻基因组大小的 5.1 倍。
关键词 云南药用野生稻；细菌人工染色体(BAC)文库
收稿 2004-05-08 修定 　 2004-12-01
资助　 国家自然科学基金重点项目(3006900)、国家自然科
学基金(30460019)、云南省自然科学基金重点项目
(2004C0010Z)和云南大学 211 工程二期建设及植物学
博士点项目。
* 通讯作者(E-mail: shnchen@ynu.edu.cn, Tel：0871-
5034670)。
我国有 3 种野生稻，即普通野生稻(Oryza
rufipogon)、药用野生稻(O. officinalis)和疣粒野生
稻(O. granulata)。野生稻是水稻育种的重要物质
基础。但云南的野生稻和全国其它的野生稻一
样，已处于濒危状态[1]。
细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，
BAC)是新近发展起来的一种载体系统，具有克隆
容量大、遗传特性稳定、转化效率高、易于操
作等优点，在基因组文库构建和基因的快速克隆
等方面已得到广泛应用。目前，包括大多数重要
农作物在内的几十种植物(http://hbz.tamu.edu)、
动物[2,3]甚至线粒体等细胞器[4]的 BAC文库已构建
完毕或正在构建。国内，BAC 文库的构建及应用
也得到了快速发展[4~10]。
云南药用野生稻核基因组 BAC 文库构建的目
的在于有效、永久保存和利用其基因资源，快速
克隆重要经济和抗逆性状基因。
材料与方法
野外采集的药用野生稻(Oryza officinalis) 种
植于温室中，收集嫩叶用于提取核基因组 DNA。
仪器主要有：高速冷冻离心机(Beckman 公
司)、脉冲场电泳仪(BIO -RAD 公司)、电泳仪、
电激转化仪(CHEF，BIO -RAD 公司)、凝胶成像
系统 GDS-7501(UVP 公司)等。
溶液和试剂主要有 DNA提取贮存液(10×HB):
0.1 mol·L-1 Tris、0.8 mol·L-1 KCl、0.1 mol·L-1
EDTA、10 mmol·L-1 精胺、10 mmol·L-1 亚精胺,
pH 9.4~9.5, 贮存于 4℃冰箱中备用。1×HB：
10×HB、0.5 mol·L-1 蔗糖、0.15% b- 巯基乙醇。
洗涤液：1×HB、0.5% 聚乙二醇辛基苯基醚、0.5
mol·L-1 蔗糖、0.15% b- 巯基乙醇。裂解液：0.5
mol·L-1 EDTA(pH 9.0~9.3)、1% 十二烷基肌氨酸
钠、0.5 mol·L-1 蛋白酶 K。SOC 培养基：2% 蛋
白胨、0.5% 酵母粉、10 mmol·L-1 NaCl、2.5
mmol·L-1 KCl、20 mmol·L-1 葡萄糖、10 mmol·L-1
MgSO4、10 mmol·L-1 MgCl2。采用美国Epicentre
公司的 CopyControlTM BAC 克隆试剂盒，包括：
CopyControlTM pCC1BACTM 载体、Fast-LinkTM DNA
连接酶、Fast-LinkTM 100× 连接缓冲液、 EP1300
感受态细胞、A T P 等。氯霉素、精胺和亚精胺
为 Sigma 公司产品，琼脂糖、l Ladder PFG 分
子量标准购自New England Biolabs公司。
制备高分子量核基因组DNA时，参照Zhang[11]
的方法提取细胞核。收集的细胞核液于45℃水浴
技术与方法 Techniques and Methods
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中预热5 min，加入等体积45℃预热的1%低熔点
琼脂糖混匀。将上述混合液快速分装入琼脂糖凝
胶块模子中，静置凝固约 1 h，形成琼脂糖凝胶
块(Plug)。将Plug转移到5~10倍的含蛋白酶K裂
解溶液中，在 50℃的环境中轻微摇晃 48 h，充
分裂解细胞核膜。裂解后的Plug放在20倍体积冰
冷的T10E1(含0.1 mmol·L-1 苯甲基磺酰氟)中[8]，置
于冰上 1 h，重复洗 3 次。再用无苯甲基磺酰氟
的冰冷的 T10E1 洗 3 次。此时，Plug 中包含制备
好的高分子量基因组DNA，将 Plug 放入 T10E1 中，
于 4℃下储存备用。
构建文库时，用0.8 U EcoRI 酶，37℃下酶
切8 min，按下列条件脉冲电泳[11]: 温度12.5℃，
电泳角度120°，脉冲时间5~50 s，电压6 V·cm-1，
电泳时间 18 h。切下 DNA 分子量在 100~300 kb
的胶条于透析袋中，电泳透析回收 DNA 大片段。
大片段 DNA 与载体以 4∶1 浓度连接后与大肠杆
菌感受态细胞进行电激转化(条件为：1.5 kV，25
mF，200 W)，转化物悬浮于 1 mL SOC 培养基
中，放在37℃摇床上培养1 h。涂于培养平板上，
37℃下培养 24~36 h。人工挑取白色菌落，直接
接种到含有80 mL 冻存培养液的384 孔培养平板
上，37℃下培养至培养液变浑浊，贮存于 -70℃
冰箱中。
文库鉴定与分析时，随机挑取若干单个白色
克隆分别接种到含氯霉素(12.5 mg·mL-1)的LB培养
基中培养。用碱裂解法提取质粒 DNA，NotI 酶
解后，脉冲电泳[11](条件为：温度 12.5℃，脉冲
角度120°，脉冲时间5~15 s，脉冲电压6 V·cm-1，
电泳时间 16 h)。溴化乙锭(EB)染色，于紫外光
下检测插入的 DNA 片段大小。检测 BAC 克隆的
稳定性时，随机挑选 3 个 BAC 克隆分别接种于
5 mL含氯霉素(12.5 mg·mL-1)的LB培养基中进行继
代培养，分别提取第 1 代和第 100 代细菌培养物
中 BAC 克隆质粒 DNA，NotI 酶解后，脉冲电泳
检查 BAC 克隆在继代培养前后是否有变化。
实验结果
1 高分子量DNA 的获得
按下列浓度梯度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、
1.0、1.5、2.0、5.0 U)加限制性消化酶 EcoRI，
于 37℃下分别酶切 6、8、9、10、12 min 等，
部分酶切的DNA片段大小主要集中在100~300 kb
的酶浓度为最佳酶浓度。经过多次实验比较，确
定酶切时间8 min的较适宜酶浓度为0.6~1.0 U，
其中 0.8 U 为最佳酶浓度。
据此，我们建立了一种有效的提取野生稻核
基因组大片段 D N A 的技术体系，重复性好，每
次都能够获得大量的大片段 DNA。通过与 l DNA
浓度梯度比较来确定大片段 DNA 浓度(图 1)。
2 核基因组大片段DNA的连接转化
通过多次连接转化实验，优化了野生稻核基
因组大片段 DNA 的连接转化条件，以 25 ng 的
pCC1BACTM 载体与约100 ng的大片段连接；2 mL
连接产物与50 mL感受态细胞混匀后电激转化的效
果为最好，每次转化都能够得到较多的白色克
隆，出现的蓝色克隆都少于 1%，符合 BAC 文库
构建所要求的转化标准。
3 BAC 文库的限制性酶切分析
随机挑取 80 个克隆，以限制酶 NotⅠ酶切检
测，每个克隆子都含有插入片段(图 2)，其大小
分布在40~200 kb，平均长度约为80 kb(图 3)。
据此计算，所建云南药用野生稻文库的容量约为
药用野生稻基因组 DNA 含量 430 Mb(参照水稻基
因组)的 5.1 倍，达到了建库所要求的理论值。
图1 大片段DNA
1~3 分别为 10、20、50 ng l DNA；4~7 为大片段 DNA。
图2 BAC克隆 NotⅠ酶切图谱
M: l DNA 梯级分子量标准; 1~15: BAC 克隆 /NotI。
4 文库的稳定性分析
BAC 载体系统较 YAC 的明显优点之一就是其
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净的细胞核是浅黄色，若颜色偏绿，可通过增加
洗涤次数和降低离心速度来减少叶绿体的污染。
该文库平均插入大小为80 kb。理论上，BAC
文库最大插入片段在300 kb以上。但是目前已报
道的 B A C 文库插入大片段平均大小范围都只在
80~160 kb。本文尽管在增大插入片段上做了不少
努力，用 200~400 kb 的大片段构建文库时，也
只有极少克隆达到 200 kb，远小于 300 kb。这
可能是回收的大片段并非是真正酶切下来的，而
是机械切断导致连接不上所造成的；也可能与转
化参数有关，大分子不易进入大肠杆菌。我们认
为适当减小电场强度可提高大分子 DNA 的转化效
率。提高插入片段平均大小，使其接近理论值是
我们今后进一步研究的目标。
本文库包含27 500个克隆，覆盖整个药用野
生稻基因组的5.1倍，不仅较完整地保存了云南药
用野生稻核基因组，而且可用于药用野生稻重要
性状基因及全基因组的物理作图、重要农艺性状
基因的图位克隆、基因结构及功能分析等研究。
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插入片段非常稳定。图 4 表明，随机挑取文库中
3个克隆经继代培养，第100代插入片段的酶切图
谱与第 1 代的无任何明显差异，说明所构建的云
南药用野生稻 BAC 文库是稳定的。
图4 BAC克隆的稳定性
M 为 l DNA 梯级分子量标准; 1 为第 1 代; 2 为第 100 代。
图3 BAC文库插入片段的分布
8 0 个克隆分析结果。
讨　　论
BAC 文库构建对于基因组较大的真核生物基
因组学研究很重要，构建过程中涉及的步骤较
多，难度大，其中的任何一个环节发生错误都有
可能造成整个实验前功尽弃。
高分子量核基因组 DNA 的制备是构建BAC 文
库的一大难关，关键一步是将细胞核包埋在琼脂
糖凝胶块中的质量，包括细胞核的质量和浓度、
琼脂糖凝胶的浓度等因素。若细胞核在包埋之前
破裂、细胞核浓度太低、琼脂糖浓度过高等都会
造成失败。包埋的琼脂糖浓度过高，会影响酶切
效果，甚至造成无法酶切。大片段的操作除酶切
外全部在冰上进行，这样就有效防止 DNA 的物理
损伤和降解。选用绿色新发的嫩叶为原材料，对
粗提细胞核进行洗涤可以减少叶绿体的污染。纯