全 文 ：植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月 141
收稿 2007-01-07
资助 贵州省中药现代化专项项目[(2003)22 号]。
* 通讯作者(E-mail：xiaolei0501@sohu.com；Tel：
0851-6770942)。
AFLP 技术在天麻遗传变异研究中的初步应用
谢渊1，张小蕾2,*，李毅1，蒋朝晖3，单可人1，吴晓黎3
贵阳医学院1 分子生物学重点实验室，2 医学检验系，贵阳 550004；3 贵阳中医学院，贵阳 550003
Preliminary Application of AFLP for Study on Gastrodia elata Genetic Diversity
XIE Yuan1, ZHANG Xiao-Lei2,*, LI Yi1, JIANG Zhao-Hui3, SHAN Ke-Ren1 , WU Xiao-Li3
1Key Laboratory of Molecular Biology, 2Department of Laboratory Science, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, China;
3Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550003, China
提要：为探讨 AFLP 技术在天麻遗传变异研究的应用，选取 11 对 AFLP 引物对 11 份不同来源天麻品种之间遗传关系进行
AFLP 分析的结果表明，11 对引物共扩增出 543 条扩增带，每个引物组合在个体间扩增条带的数目有 33~83 条，平均为
49.5。采用 UPGMA 法聚类分析得到的天麻各品种之间遗传距离为 0.0792~0.6004。UPGMA 聚类图显示，11 份样品分为
两大组群，其中的贵州天麻一群又分为 2 个组群。
关键词：天麻；扩增片段长度多态性(AFLP) ；遗传变异
天麻作为名贵中药，对其研究的报道已很多
(邓士贤和莫云强1979；周铉和陈心启1983)，但
对天麻遗传多样性的报道还少见。本文用扩增片
段长度多态性(amplified fragment length
polymorphism，AFLP)技术(Vos 等 1995)，构建
了 11 个天麻品种的 DNA 指纹图谱，采用其遗传
多样性对天麻品种鉴定进行探讨，以期能为中药
天麻提供一种稳定、快速和准确的鉴定方法。
材料和方法
1 材料
贵州大方地区、乌当地区、雷公山地区野生
和人工栽培天麻的 3 个品种：‘红杆天麻’(G a -
strodia elata Bl. f. elata)、‘黄杆天麻’(G. elata
Bl. f. flavida S. Chow)、‘乌杆天麻’(G. elata f.
glauca S. Chow)以及云南天麻鲜品，材料名称及来
源见表 1。取其地下块茎或鹦哥嘴嫩芽洗净，刮
弃表皮，以避免共生蜜环菌污染，留其核心成分
提取天麻基因组 D N A。
2 仪器与试剂
主要仪器：PE2400 PCR 仪、DYY-III 20B
型电泳槽、 BIO-RAD power/PAC3000电泳仪。引
物和接头均由上海生工生物工程有限公司合成，
序列见表 2。限制性内切酶购自 NEB 公司，T4-
DNA 连接酶购自 Promega 公司，Taq DNA 聚合酶
购自 Promega 公司和华美公司。
3 方法
3.1 基因组 DNA的提取 采用我组改进的CTAB/
SDS 方法(李毅和张小蕾 2005)。
3.2 模板DNA酶切-连接 用限制性内切酶MseI
和 PstI双酶切，然后连接上通用接头。酶切-连
接混合液包括2.5 mL DNA (200 ng·mL-1 )、MseI 3
U、PstI 3 U、NEB缓冲液1.0 mL、MseI接头和PstI
接头 1.0 mL、10×Ligase缓冲液 2.5 mL、牛血清
白蛋白(BSA) 0.2 mL、T4-DNA 连接酶 0.5 mL，
加双蒸水至25 mL，于 37 ℃下酶切-连接 10 h。
3.3 预扩增 预扩增采用M+0/P+0引物组合，取
2 mL 酶切 -连接完成的 DNA 样品，依次加入 0.6
mL MseI引物M00 (50 ng·mL-1)、0.6 mL PstI引物
P00 (50 ng·mL-1)、2.0 mL 10×PCR 缓冲液(50
mmol·L-1 KCl；10 mmol·L-1 Tris-HCl，pH 8.3；
1.5 mmol·L-1 MgCl2；0.1%明胶)、1.2 mL的MgCl2
(25 mmol·L-1)、1.6 mL dNTP (2.5 mmol·L-1)、
0.2 mL Taq DNA 酶 (5 U·mL-1)，加双蒸水至
20 mL。反应条件为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，
56 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，共36个循环；最后于
72 ℃下延伸 5 min。预扩增完成后，用超纯水稀
释 15 倍，贮于 -20 ℃中保存待用。
植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月142
3.4 选择性扩增 选择性扩增选用M+3/P+3、M+2/
P+3引物组合，共选用11对引物。取2 mL 稀释后
的预扩增产物，加入1 mL MseI引物 (50 ng·mL-1)、
1 mL PstI引物 (50 ng·mL-1 )、2.0 mL 10×PCR 缓冲液
(50 mmol·L-1 KCl；10 mmol·L-1 Tris-HCl，pH 8.3；
1.5 mmol·L-1 MgCl2；0.1%明胶)、1.2 mL的MgCl2
(25 mmol·L-1)、1.6 mL dNTP (2.5 mmol·L-1)、0.2
mL Taq DNA 酶 (5 U·mL-1)，加双蒸水至 20 mL。
反应条件为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，
72 ℃ 80 s，共12个循环，每个循环降低0.7 ℃；
95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，共23个循
环，最后于 72 ℃下延伸 5 min。
3.5 扩增产物的凝胶电泳分析 选择扩增后的样品
中加入5 mL上样缓冲液 (98%甲酰胺；10 mmol·L-1
EDTA，pH 8.0；0.25% 溴酚蓝；0.25% 二甲酚
蓝)，于 95 ℃下变性8 min，然后迅速放入冰浴
中冷却，在功率为 80 W 下用 5% 的聚丙烯酰胺凝
胶电泳 2 h，含预电泳(40 min)。银染检测扩增
产物(Bassam 等 1995)。
3.6 数据分析 每个样品AFLP的扩增谱带按有无
分别赋予 1 或 0，以获得矩阵。不同引物组合的
扩增效果用多态性信息指数(PIC)表示(郝晨阳等
2003)。按公式：PIC=S(1-pi2)/n 计算。其中，
pi为任一引物组合第i条多态性带在所有供试材料
中出现的频率；n 为供试材料的总数。
用NTSYS-pc 2.1 软件中的DICE 法计算品种
之间的相似系数，按公式Gs=2Nxy/(Nx+Ny)计算。
其中，Nxy 为任意两品种共享谱带数；Nx 和 Ny
分别代表每个品种总的带谱数。根据品种间遗传
距离(D)公式 D=1-G s 得到品种间遗传距离。用
U P G M A 法进行聚类分析，绘制树状聚类图。
实验结果
1 AFLP扩增结果
11 对引物组合对11 份天麻标本进行的AFLP
分析都得到清晰的指纹，共扩增出清晰可辨的条
带543条(表3)。每个引物组合在个体间扩增条带
的数目在 33~83 条，平均为 49.5；平均 PIC 为
0.32，变化范围为0.28~0.37，其中，P66/M54、
P42/M49 这 2 对引物组合的 PIC 值达到或超过
0.35。这些引物组合扩增出的多态性谱带数也反映
其扩增产物具有较高的多态性(图 1)，据此认为在
天麻遗传多样性研究中应优先采用这些引物组合。
表1 天麻品种及其来源
编号 　　　　　品种 　　　　　来源 　　　　　　　生态生理特性
1 ‘乌杆天麻人工栽培 2 代’ 贵州大方县云龙天麻开发基地 地下块茎呈椭圆形、不规则，海拔 1 51 0 m
2 ‘乌杆天麻人工栽培 1 代’ 贵州大方县云龙天麻开发基地 地下块茎呈长椭圆，海拔 1 510 m
3 品种名不清(天麻鲜品) 云南省 不详
4 ‘黄杆天麻 0 代种麻’ 贵州大方县云龙天麻开发基地 地下块茎呈小梭形，海拔 1 000 m
5 ‘黄杆天麻 0 代种麻’ 贵州大方县云龙天麻开发基地 地下块茎呈小梭形，海拔 1 510 m
6 ‘红杆天麻人工栽培多代’ 贵州大方县大方镇龙昌坝 地下块茎呈长梭形，海拔 1 000 m 以下
7 ‘红杆天麻人工栽培多代’ 贵州大方县黑桃乡锅厂 地下块茎呈长梭形，海拔 1 200 m
8 ‘红杆天麻’ 贵州贵阳乌当区百宜乡 地下块茎呈长梭形，海拔 1 300 m
9 ‘野生乌杆天麻’ 贵州台江县雷公山 地下块茎呈椭圆形，标本不完整，海拔 1 820 m
10 ‘野生乌杆天麻’ 贵州台江县雷公山 地下块茎呈长梭形，海拔 1 820 m
11 ‘野生乌杆天麻’ 贵州雷山县雷公山 地下块茎呈椭圆，海拔 1 750 m
表2 AFLP人工接头和引物序列
引物 　　　　　　　序 列
PstI接头 5’ CTCGTAGACTGCGTACATGCA 3’
3’ CATCTGACGCATGT 5’
P00 5’ GACTGCGTACATGCAG 3’
P35 5’ GACTGCGTACATGCAGACA 3’
P42 5’ GACTGCGTACATGCAGAGT 3’
P66 5’ GACTGCGTACATGCAGGAT 3’
P71 5’ GACTGCGTACATGCAGGGA 3’
MseI 接头 5’ GACGATGAGTCCTGAG 3’
3’ TACTCAGGACTCAT 5’
M00 5’ GATGAGTCCTGAGTAA 3’
M22 5’ GATGAGTCCTGAGTAAGT 3’
M49 5’ GATGAGTCCTGAGTAACAG 3’
M54 5’ GATGAGTCCTGAGTAACCT 3’
植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月 143
2 AFLP数据的聚类分析
采用DICE 系数对 11 个天麻标本进行遗传相
似系数Gs 和遗传距离计算，所得遗传距离矩阵的
结果(表4)表明，不同天麻标本间遗传距离差异较
大(0.0792~0.6004)，表明天麻各品种的遗传多样
性十分丰富。采用上述 AFLP 数据进行聚类分析，
绘制出树状图(图 2)。在 45% 的相似水平上，聚
类图将11个品种分为2大群。有趣的是云南鲜品
独立成为 1 个群，而贵州各地天麻品种归为另一
群。在 60% 的相似水平上，贵州天麻又分为 2 个
亚群，仍然按天麻的来源进行分类，雷公山地区
的天麻聚为一类，大方地区天麻聚为另一类，说
明天麻类群划分结果与它们的地理区域分类相吻
合。对于不同品种天麻来说，可能是由于样本较
少的缘故，未显示出明显的特征。
表3 11对引物组合的AFLP扩增产物多态性比较
引物编号 　引物组合 扩增多态性带数 PIC
P35/M22 P-ACA/M-GT 　　　83 0.28
P35/M49 P-ACA/M-CCT 　　　56 0.31
P35/M54 P-ACA/M-CAG 　　　40 0.31
P42/M22 P-AGT/M-GT 　　　49 0.28
P42/M49 P-AGT/M-CCT 　　　50 0.35
P42/M54 P-AGT/M-CAG 　　　34 0.33
P66/M22 P-GAT/M-GT 　　　69 0.30
P66/M49 P-GAT/M-CCT 　　　39 0.30
P66/M54 P-GAT/M-CAG 　　　45 0.37
P71/M22 P-GGA/M-GT 　　　45 0.32
P71/M49 P-GGA/M-CCT 　　　33 0.34
合计 　　 543 0.32
表4 各天麻品种间的遗传距离
品种编号 　 1 　 2 　 3 　 4 　 5 　 6 　 7 　8 　 9 10 11
1 —
2 0.0792 —
3 0.5672 0.5543 —
4 0.2284 0.2228 0.5488 —
5 0.1584 0.1676 0.6004 0.2026 —
6 0.1252 0.1418 0.5414 0.1584 0.1584 —
7 0.1179 0.1197 0.5783 0.1879 0.1621 0.1326 —
8 0.1087 0.1215 0.5581 0.2560 0.1861 0.1492 0.1419 —
9 0.4862 0.4807 0.5083 0.4309 0.4862 0.4384 0.4715 0.4954 —
10 0.4457 0.4512 0.5157 0.4502 0.4126 0.4126 0.4568 0.4586 0.4163 —
11 0.5046 0.5064 0.4789 0.4457 0.4715 0.4568 0.4973 0.5212 0.3131 0.3868 —
讨　　论
AFLP 是基于 RLFP 和 RAPD 的 PCR 方法，是
目前国际上构建 DNA 指纹图谱的最新方法之一。
AFLP技术能检测到大量的基因位点，灵敏度和分
辨率都很高，而且具有良好的重复性。选用不同
的引物组合，不同基因型 DNA 可以有不同的酶切
位点，从而产生扩增片段的长度多态性，即使亲
缘关系很近的品种间 DNA 差异也可以检测出来。
因此，此项技术在分子生物学、遗传学及生物育
种等领域有广泛的应用前景(易干军等2002；马小
军等2000) 。
天麻作为名贵中药，其研究工作已多有报
道，但就天麻遗传多样性的报道比较少见。研究
天麻的分子标记进而分析其遗传多样性，可有助
图1 P-GGA/M-GT 引物组合11个
品种扩增的 AFLP 指纹图谱
植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月144
于天麻优良品种的选育。实验过程中发现，天麻
是植物中的一个特殊品种，它仅含有少量 DNA，
而含有大量的多酚和多糖，它们的存在将会严重
影响酶切和连接的效率，给实验带了很大的难
度。AFLP 分析对反应条件要求非常高，要想获
得稳定可靠的指纹图谱，必须对实验条件进行严
格控制。尤其是在提取天麻 D N A 过程中，务必
要除净杂质以获得高纯度 D N A 。其次，在酶切
与连接过程中，时间的掌握很重要，只有找到最
适合酶切和连接时间才可以使酶切彻底又提高工作
效率。本文将改进的常规的 CTAB 法和 SDS 法有
效结合，对天麻标本进行处理和纯化，同时将酶
切和连接两步反应相结合，于37 ℃下酶切-连接
10 h，然后通过预扩增和选择性扩增PCR 反应条
件的优化，这样方可获得稳定的结果。
天麻的 UPG M A 聚类图表明，天麻种内存在
广泛的遗传多样性，这可能是地域、气候和遗传
因素影响的结果。天麻主要靠地下块茎繁殖，也
有是异花和自花授粉有性繁殖的，繁殖方式的多
样化也可能是天麻遗传多样性的原因( 胡忠等
1999；刘成运 1981)。采自不同地区的天麻在
UPGM A 聚类中都分在不同的类群，从 DNA 水平
上来说天麻具有地域性，这表明丰富多变的地势
和气候条件也可能是天麻遗传多样性的原因之一，
同时也表明道地药材的重要性及其在栽培地域上的
局限性。相同的地域和气候条件下，相同天麻品
种出现不同的图谱，这种情况多出现于人工栽培
的天麻，这可能是同一地域栽培天麻的种麻来源
不同，也有可能是受其他来源品种的影响，以致
出现不同的 DNA 多态性。本文中样本例数可能较
少，所以不同品种天麻之间以及野生天麻和人工
栽培天麻之间的遗传分化未表现出明显的特征，
对此还需继续研究。
参考文献
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图 2 各天麻品种的 UPGMA 聚类图