全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 2期，2004 年 4 月 223
收稿 2003-05-13 修定 　 2003-10-27
资助　 国家自然科学基金(30270124、30170500)和教育部博士
点基金项目。
* 通讯作者(E-mail:dulinf@mail.sc.cninfo.net, Tel:028-
85412766)。
油菜叶绿体被膜的制备和Toc33的检测
陈云伟1 张年辉1 赵云1 杜林方1,* Masato NAKAI2
1四川大学生命科学学院，成都 610064; 2Institute for Protein Research, Osaka University, Osaka 565-0871, Japan
Preparation of Envelope Membrane of Rape Chloroplast and Detection of Toc33
CHEN Yun-Wei1, ZHANG Nian-Hui1, ZHAO Yun1, DU Lin-Fang1,*, Masato NAKAI2
1College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064; 2Institute for Protein Research, Osaka University, Osaka 565-
0871, Japan
提要 采用蔗糖密度离心方法分离完整叶绿体，进一步分离叶绿体被膜，借助 SDS-PAGE 分析了 2 种油菜叶绿体被膜的
蛋白组分。用对拟南芥叶绿体外被膜上存在 Toc33 的特异抗体，检测到油菜叶绿体被膜上存在 Toc33 转运蛋白。Toc33
在 2 种油菜中的相对含量不同，黄化油菜叶绿体被膜中高于野生油菜叶绿体被膜。
关键词 油菜叶绿体被膜；制备；Toc33 检测
叶绿体是植物进行光合作用的细胞器，具有
双层被膜：内被膜和外被膜。叶绿体中存在的蛋
白质70% 是由核基因编码，在胞质 80S 核糖体上
合成，再转运进入叶绿体的[1]。前体蛋白需要跨
过叶绿体的双层被膜，而内被膜与外被膜存在着
的转运复合体参与前体蛋白的跨膜转运。外被膜
上的转运复合体参与前体蛋白与叶绿体表面的结
合，以及依赖于 ATP/GTP 的跨外被膜转运；而
内被膜存在的转运复合体参与受 ATP 水解供能的
跨内被膜转运[2]。外被膜上的转运复合体主要由
Toc34、Toc160 和 Toc75 蛋白等构成，而内被膜
存在的转运复合体由Tic系列蛋白构成[3]。
Toc34和 Toc160为 GTP结合蛋白。有证据表
明，Toc160 参与前体蛋白的结合，而Toc34 可以
调节前体蛋白与Toc160的识别[4]。Toc75则构成外
被膜的转运通道[2]。已有的研究表明，双子叶植
物豌豆和拟南芥中存在Toc34[3]，最近，在单子叶
植物玉米中也证实存在Toc34[5]。此外，拟南芥还
含有Toc33[3]，而玉米有2个 Toc34(ZmToc34-1和
ZmToc34-2)[6]。Toc34 可以磷酸化，磷酸化的
Toc34 对 GTP 结合受到抑制，从而抑制Toc34 对
前体蛋白的结合[6]。最近，Sun等[7]报道豌豆晶体
结构。油菜(Brassica napus)叶绿素减少的突变体
Cr3529 表型[8]，与拟南芥转运突变体类似[3]。为
了探讨油菜Cr3529的突变机制，我们分离了完整
叶绿体和叶绿体被膜，检测到油菜被膜存在
Toc33，并且 2种油菜中Toc33 的相对含量不同。
材料与方法
油菜(Brassica napus)及其突变体Cr3529种植
于试验田，取第 8 、9 片真叶。
完整叶绿体的分离参考文献 9 的方法，略作
改进。新鲜叶片剪碎，加入 4 倍体积的缓冲液 A
[含300 mmol.L-1 D-山梨糖醇、 0.1％(W/V)BSA、
0.1％(V/V)b-巯基乙醇和5 mmol.L-1 EDTA 的 50
mmol.L-1 Tris-HCl液, pH 8.0]，中等速度匀浆2
min，4 层砂布和 1 层白布过滤，滤液以 700 × g
离心 10 min后，弃沉淀，上清液在2 000× g离
心 10 min，所得沉淀为叶绿体，用 A液悬浮。离
心管中制备蔗糖梯度[底部: 含52％(W/V)蔗糖和25
mmol.L-1 EDTA 的 50 mmol.L-1 Tris-HCl，pH
8.8；上部：30％(W/V)蔗糖和 25 mmol.L-1 EDTA
的 50 mmol.L-1 Tris-HCl，pH 8.8]。A液悬浮的
叶绿体上样于30％(W/V)蔗糖层的表面，50 000 ×
g、4℃离心30 min，蔗糖界面中的绿色条带为完
整叶绿体。小心吸取，用 3 倍体积 A 液稀释，以
2 000× g离心 15 min，沉淀悬浮于缓冲液B(含
150 mmol.L-1 NaCl和25 mmol.L-1 EDTA 的50 mmol.
L-1 Tris-HCl, pH 8.0)中，离心洗涤1次得到完整叶
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绿体。叶绿素含量测定采用Arnon 法[10]。
被膜组分的分离参照文献11的方法进行。完
整叶绿体悬浮在C液(含0.6 mol.L-1蔗糖和2 mmol.
L-1 EDTA的10 mmol.L-1 Tris-HCl, pH 7.5)中至叶绿
素为1.5 mg.L-1，于 -20℃中迅速冷冻2 h，再于
室温下放置融化，保证完全叶绿体的破裂。破碎
后的叶绿体以4 500×g 离心15 min 1次，所得上
清液再离心1次以尽量除去类囊体，再以40 000×
g 离心 30 min，所得沉淀为叶绿体被膜蛋白。蛋
白质含量测定采用Lowry法[9]，以 BSA为标准品。
SDS-PAGE按文献12的方法进行，用13.75％
的分离胶和5％的浓缩胶，上样量28 mg 蛋白质。
电泳后的胶板一分为二，一份用考马斯亮蓝R-250
染色，另一份电转移至硝酸纤维膜后，进行蛋白
印迹并用丽春红染色，检测转移是否完全。
电转移和免疫印迹分析参照文献 13 的方法，
4℃下恒流 400 mA 转移 4 h。硝酸纤维膜经封闭
后，与一抗(对拟南芥Toc33特异的抗体，Masato
Nakai 提供)温育，再与蛋白IgG-HRP(与辣根过氧
化酶共价偶联的免疫球蛋白蛋白G)温育后，以新
鲜配制的4- 氯萘酚为底物进行显色。
结果与讨论
1 完整叶绿体的分离
叶片匀浆后常采用蔗糖梯度或Percoll梯度离心
的方法分离完整叶绿体。我们参照文献9 的方法，
并略作改进，采用52％~30％蔗糖梯度离心的方
法。叶片剪碎后中等速度匀浆，过滤后的滤液离
心，得到的上清液再离心，沉淀为叶绿体，再经
52％~30％蔗糖梯度离心。离心后，经检测呈现浅
绿色的30% 蔗糖组分中，含有破碎的叶绿体，蔗
糖界面之间的深绿色条带为完整叶绿体，未破碎的
细胞沉淀于52% 蔗糖底部。取蔗糖界面的深绿色
带，稀释后离心所得到的沉淀为完整叶绿体。
100 g鲜重的野生型油菜和突变体Cr3529叶片
可以分别得到3.12和2.85 mg叶绿素量的完整叶绿
体，其中突变体Cr3529 较少(表 1)。实验中曾采
用软浆叶和豌豆等材料，由100 g鲜重叶片中，可
以分别得到5.25和 4.55 mg叶绿素量的完整叶绿
体。油菜得率较低的原因尚不清楚。
匀浆速度和时间、蔗糖梯度的制备和完整叶
绿体的吸取是实验的关键。采用中等速度匀浆 2
min 即可，时间过长，叶绿体会破碎，会降低完
整叶绿体的得率；制备蔗糖梯度时，界面要清
晰，上样应小心，待平衡后再离心；应小心吸
取完整的叶绿体，动作要轻微。
2 叶绿体被膜的制备
完整叶绿体的破裂有研磨法和冻融法，文献
报道前者可破裂 50％~70％叶绿体，而后者可破
裂70％叶绿体[3]。我们采用冻融法进行叶绿体的
破裂，然后离心先除去类囊体膜，再分离得到被
膜组分。
由100 g野生型油菜和突变体Cr3529叶片所
分离的完整叶绿体，除类囊体时4 500×g离心1
次，可以分别制备得到蛋白量分别为580和189 mg
的叶绿体被膜(表1); 除类囊体时离心2次，可以
从100 g叶片中制备得到蛋白量分别为28.8和28.2
mg 的叶绿体被膜。叶绿体被膜本身无色，类囊
体膜含有叶绿素而呈绿色，与类囊体相比，叶绿
体被膜只占很小的一部分，因此从破裂的叶绿体
除类囊体时离心 2 次，尽量除去类囊体膜，提高
被膜的纯度，但是得率显著降低。分离的被膜仍
带浅绿色，表明含有少量的类囊体膜。由于样品
量较少，我们没有再进一步分离内外被膜。
采用 SDS-PAGE 电泳对分离过程中完整叶绿
体、类囊体和被膜的蛋白组分进行分析(图1)，结
果表明：与完整叶绿体相比，类囊体膜具有较多
的分子量为28~30 kD的 LHCII蛋白，突变体类囊
体膜的 LHCII 组分也比野生型的少；野生型油菜
叶绿体被膜可以分离出近20条主要蛋白带，其中
分子量为28和 90 kD的是内被膜的主要蛋白，75
kD 为外被膜的蛋白。突变体叶绿体被膜的蛋白组
分与野生型的几乎没有差别。
表1 不同材料叶片提取叶绿体和被膜的比较
完整叶绿体 叶绿体被膜

油菜类型
叶绿素/mg 蛋白量/mg 蛋白量/mg
野生型 3.12 3.30 579.7
Cr3529 突变型 2.85 4.55 189.1
按 100 g 新鲜叶片计算。
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3 Toc33的检测
加大上样量(28 mg蛋白质)后，SDS-PAGE分
离类囊体膜和叶绿体被膜蛋白转移到硝酸纤维素
膜，经丽春红染色显示转移完全，用对拟南芥
Toc33 特异的抗体进行免疫印迹反应。免疫印迹
结果(图2)显示：两种油菜类囊体膜中均检测不到
杂交带；而野生型油菜及其突变体的叶绿体被膜
中，均有1条明显的、分子量为33 kD的杂交带，
表明油菜叶绿体被膜中存在 Toc33 蛋白。以相同
蛋白上样量时，突变型油菜叶绿体被膜所含
Toc33 略高于野生型油菜叶绿体被膜。这与拟南
芥转运突变体明显不同[3]，拟南芥转运突变体由
于T-DNA 的插入，导致 Toc33 编码基因失活，叶
片出现黄化。油菜与拟南芥都是十字花科的双子
叶植物，它们的亲源关系近。用拟南芥 Toc33 特
异的抗体可以在油菜叶绿体被膜中检测到油菜存在
Toc33 蛋白，表明它们的同源性高。据此，我们
认为：油菜突变体Cr3529可能不是Toc33的转运
突变体。
采用分离得到的完整叶绿体可以进行前体蛋
白的体外导入实验，而制备的叶绿体被膜，还可
以进一步用于制备外被膜和内被膜，进行转运复
合体的研究。
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图2 免疫印迹检测Toc 33
WT:野生型；MT:突变体。被膜蛋白质上样量 28 mg；类
囊体蛋白质作为对照上样量50 mg。
图 1 2 种油菜叶绿体、类囊体膜和被膜的 SDS-PAGE
M ：标准分子量蛋白；W T ：野生型；M T ：突变体。被
膜蛋白质上样量为10 mg；叶绿体和类囊体蛋白质上样20 mg。
考马斯亮蓝 R-250 染色。