全 文 ：植物生理学通讯 第43卷 第1期，2007年2月 109
毛泡桐同源四倍体的诱导
范国强*，杨志清，曹艳春，翟晓巧
河南农业大学泡桐研究所，郑州450002
提要：在含有不同浓度秋水仙素双层培养基上以叶片作外植体诱导毛泡桐同源四倍体植株，用变异植株根尖细胞染色体
计数和成熟叶片中单细胞 DNA 含量测定的方法进行倍性分析。结果表明，在 16 个试验组合中，预培养 6 d 的毛泡桐叶
片经 20 mg·L-1 秋水仙素处理 72 h 的四倍体诱导率可达 20%。
关键词：毛泡桐；叶片；秋水仙素；四倍体；培养基
Induction of Autotetraploid of Paulownia tomentosa (Thunb.) Steud
FAN Guo-Qiang*, YANG Zhi-Qing, CAO Yan-Chun, ZHAI Xiao-Qiao
Institute of Paulownia, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: Induction of autotetraploid of Paulownia tomentosa from the leaves of the diploid with different
concentrations of colchicines on the double MS media through chromosome numbering of the plant tip cells
and DNA content in leaf cell were investigated. The results indicated that the highest tetraploid induction rate
might reach 20% from the leaves pre-cultured for 6 d and treated with 20 mg·L-1 colchicine for 72 h on the
double media among 16 experiment combinations.
Key words: Paulownia tomentosa; leaf; colchicine; tetraploid; medium
收稿 2006-10-23 修定 　2006-12-18
资助 河南省高校创新人才基金(2002012)。
*E-mail：zlxx64@sohu.com；Tel：0371-63558077
目前，泡桐生产中存在的丛枝病和低干大冠
等问题还未得到解决。根据多倍体植物有较强抗
逆能力的看法(康向阳等 2 0 0 4；李云和冯大领
2005；杨今后 2004)，人们自然而然地产生了泡
桐多倍体可能会解决这些问题的思路。对此，平
吉功(1950)曾用种子开展过毛泡桐多倍体诱导，
但诱导率低，并且诱导的植株也没有保存下来。
此后，再也未见有泡桐四倍体植株诱导的报道。
近年来，随着泡桐体外植株高效再生系统的完善
(范国强等2002，2005；翟晓巧等2004；Bergman
和 Moon 1997；Rao 等 1996)，采用组织培养技
术建立毛泡桐四倍体诱导体系以提高毛泡桐四倍体
诱导率的想法又萌动起来。本文就是在这样的思
路下开展这项研究的。
材料与方法
材料为我所用种子培养80 d的毛泡桐[Paulownia
tomentosa (Thunb.) Steud]组培苗叶片。秋水仙素
处理毛泡桐无菌苗叶片试验采用L12(34)正交设计
(袁志发和周静芋2000)。秋水仙素浓度为5、10、
20 和 30 mg·L-1，外植体预培养时间为 0、6、12
和18 d，秋水仙素处理时间为24、48、72和96 h
(表 1)。处理时，将毛泡桐无菌苗叶片剪成 0.5
cm×1.0 cm 的小块(外植体)，分别接种于盛有40
mL MS+0.1 mg·L-1 NAA+15 mg·L-1 BA 培养基(翟晓
巧等2004)的容积为100 mL的三角瓶中，预培养
0、6、12 和 18 d 后，放在秋水仙素浓度分别为
5、10、20和 30 mg·L-1 的双层培养基[2层培养基
含有相同的MS+0.1 mg·L-1 NAA+15 mg·L-1 BA 成
分，不同的是上层为 10 mL 加入秋水仙素的液体
培养基(不加琼脂粉)，下层为30 mL 加入相同浓
度秋水仙素的固体培养基(上铺2层无菌滤纸)]上，
然后，在温度为20 ℃的黑暗条件下处理24、48、
72 和 96 h。处理结束后，先用无菌水清洗外植
体 3 次，再用无菌滤纸吸干外植体表面液体后转
到不含秋水仙素的上述固体培养基上，于温度为
(25±2) ℃、光强为130 µmol·m-2·s-1、光照时间
16 h·d-1的培养室内培养。每一处理60个外植体。
40 d时统计外植体存活率(存活外植体数/放置外植
体总数)及芽诱导率(诱导出芽的外植体个数/放置
外植体总数)，并选取长约 2 cm 的幼芽转入 1/2
MS+0.1 mg·L-1 NAA 培养基中诱导生根，20 d 后
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剪其2 cm长顶芽放到生根培养基中继代培养。每
20 d 继代一次，共继代5次。第5次继代苗培养
20 d时，先剪其根尖制临时压片放于尼康TS-100
荧光倒置显微镜(×2 000)下进行染色体(舒寿兰
1985)观察，再用流式细胞仪测定染色体数变化的
毛泡桐幼苗叶片单细胞的 D N A 含量( H c i n i 等
2006)，以确定诱变植株的倍性。同时，计算四
倍体诱导率(流式细胞仪确认诱导出四倍体的外植
体数 / 放置外植体总数)。每组试验重复 2 次。
的不同表现出一定的差异。因此认为，在用毛泡
桐叶片进行四倍体诱导时，要考虑秋水仙素浓度
和处理时间以及叶片预培养时间三因素的综合效
应。以在 A3B3C2 组合中的毛泡桐叶片四倍体诱导
率最高。即将经过预培养6 d的毛泡桐叶片放在浓
度为20 mg·L-1的秋水仙素双层培养基中处理72 h后
得到的四倍体诱导率最高。
表 1 正交设计的试验组合
Table 1 Orthogonal design of treatment combination
A (秋水仙素 B (处理时间)/h C (外植体预 浓度)/mg·L-1 培养时间)/d
A1 (5) B1 (24) C2 (6)
A1 (5) B2 (48) C3 (12)
A1 (5) B3 (72) C1 (0)
A1 (5) B4 (96) C4 (18)
A2 (10) B1 (24) C3 (12)
A2 (10) B2 (48) C2 (6)
A2 (10) B3 (72) C4 (18)
A2 (10) B4 (96) C1 (0)
A3 (20) B1 (24) C1 (0)
A3 (20) B2 (48) C4 (18)
A3 (20) B3 (72) C2 (6)
A3 (20) B4 (96) C3 (12)
A4 (30) B1 (24) C4 (18)
A4 (30) B2 (48) C1 (10)
A4 (30) B3 (72) C3 (12)
A4 (30) B4 (96) C2 (6)
结果与讨论
1 秋水仙素处理对毛泡桐叶片四倍体诱导率的影响
由秋水仙素对毛泡桐叶片影响的结果(表2)可
以看出，秋水仙素浓度和处理时间以及叶片预培
养时间对毛泡桐叶片存活率、芽诱导率和四倍体
诱导率的影响存在一定的差异。随着秋水仙素浓
度的升高，毛泡桐叶片最高存活率和最高芽诱导
率逐渐下降，而最高四倍体诱导率则出现先上升
后下降的趋势。这意味着秋水仙素浓度越高越易
导致毛泡桐叶片最高存活率和最高芽诱导率的快速
下降。秋水仙素浓度过大过小都不利于毛泡桐四
倍体的诱导。此外，叶片预培养时间和秋水仙素
处理时间与四倍体诱导率的关系随着秋水仙素浓度
表2 秋水仙素对毛泡桐四倍体的诱导
Table 2 The induction of tetraploid of P. tomentosa plants
with colchicine
组合 存活率/% 芽诱导率/% 四倍体诱导率/%
A1B1C 2 36.7 18.3 0
A1B2C 3 35.0 20.0 8.3
A1B3C 1 30.0 16.7 6.7
A1B4C 4 40.0 36.7 11.7
A2B1C 3 25.0 18.4 16.7
A2B2C 2 20.0 15.0 15.0
A2B3C 4 36.7 33.3 11.7
A2B4C 1 18.3 11.7 8.3
A3B1C 1 28.3 18.3 11.7
A3B2C 4 35.0 31.3 15.0
A3B3C 2 26.7 20.0 20.0
A3B4C 3 16.7 11.7 11.7
A4B1C 4 33.3 26.7 11.7
A4B2C 1 28.3 11.7 8.3
A4B3C 3 18.4 16.7 16.7
A4B4C 2 8.3 6.7 6.7
图1 四倍体和二倍体毛泡桐细胞染色体
Fig.1 Chromosome numbers of the tetraploid and
diploid of the plants
2 四倍体毛泡桐植株的鉴定
图1和图2显示，(1)经秋水仙素处理而诱变的
毛泡桐幼苗根尖细胞的染色体条数为 2n=4x=80，
未经秋水仙素处理的幼苗根尖细胞的染色体数为
2n=2x=40。即发生诱变的毛泡桐根尖细胞中染色
体数为二倍体植株的 2 倍。也就是说，诱导变异
的毛泡桐幼苗为四倍体植株。(2)从流式细胞仪测
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定继代 5 次经秋水仙素处理的染色体发生变化植
株和二倍体植株叶片单细胞 DNA 相对含量的分布
图来看，二倍体植株仅在相对荧光强度值为50的
位置上出现1个单峰，诱导变异植株在接近100的
位置上出现1个单峰，在50和 100位置以外未出
现明显的其他峰。也就是说，变异植株叶中单细
胞的 DNA 含量为二倍体叶片的 2 倍。结合毛泡桐
诱变植株染色体的结果，可以确定经秋水仙素处
理后所获得的变异植株为四倍体植株。
总之，在目前人们用种子进行植物多倍体诱
导时，诱变植株中经常出现嵌合体和非整倍体(陈
高和孙卫邦 2006；韩礼星和张海璇 1998；李云
和冯大领 2005；罗耀武等 1997；平吉功 1950；
Hcini等2006)。其原因可能是用秋水仙素处理萌
发植物种子时，只有秋水仙素与植物种子胚芽原
基中特定的 1~3 层处于分裂中期的细胞完全作用
时，染色体才能加倍，并且这些加倍的细胞再进
一步生长发育后才能形成四倍体植株。如果秋水
仙素作用的这些细胞染色体不能全部加倍，就可
能导致嵌合体或非整倍体的植株出现。本文将预
培养6 d的毛泡桐叶片放到含有20 mg·L-1秋水仙
素的双层培养基上诱导72 h时，由于细胞分裂的
同步性较好，因此处于分裂中期的细胞与秋水仙
素作用时，其细胞中的染色体就容易加倍，并且
此部分加倍的细胞在双层培养基上通过脱分化直接
形成四倍体幼苗。所以，用此法诱导出的毛泡桐
变异植株很难有嵌合体和非整倍体植株出现。即
使有嵌合体或非整倍体植株的出现，经过 5 次继
图2 毛泡桐叶中DNA含量分布
Fig.2 Distribution of DNA content in the leaves of P. tomentosa
代后还能恢复到原二倍体状态( 李云和冯大领
2005)。因而，本试验未检测到嵌合体和非整倍
体植株。至于二倍体与四倍体植株生长量和材质
之间的差异将在后续论文中报道。
参考文献
陈高, 孙卫邦(2006). 秋水仙素诱导七里香多倍体. 植物生理学通
讯, 42 (2): 229~231
范国强, 翟晓巧, 蒋建平, 刘新诚(2002).不同种泡桐叶片愈伤组
织诱导及其植株再生. 林业科学, 38 (1): 29~35
范国强, 翟晓巧, 马新业(2005). 两种泡桐叶片体细胞胚胎发生
及植株再生. 核农学报, 19 (4): 274~278
韩礼星, 张海璇(1998). 猕猴桃多倍体诱导研究. 果树科学, 15 (3):
273~276
康向阳, 张平冬, 高鹏, 赵芳(2004). 秋水仙碱诱导白杨三倍体新
途径的发现. 北京林业大学学报, 26 (1): 1~4
李云, 冯大领(2005). 木本植物多倍体育种研究进展. 植物学通
报, 22 (3): 375~382
罗耀武, 乔子靖, 朱子英, 皇甫中泗, 常金华(1997). 人工诱变获
得四倍体玫瑰香葡萄的研究. 园艺学报, 24 (2): 125~128
舒寿兰(1985). 四种泡桐染色体数目的初步研究. 河南农业大学
学报, 19 (1): 48~50
杨今后(2004). 桑树四倍体的诱导及其应用. 桑业科学, 30(1): 6~10
袁志发, 周静芋(2000). 试验设计及统计. 北京: 高等教育出版社
翟晓巧, 王政权, 范国强(2004). 泡桐体外器官直接发生的植株
再生. 核农学报, 18 (5): 357~360
平吉功(1950). 森林植物における人为倍数の研究. II. キソ倍数
体におけるの观察. Seikenziho, 4: 17~21
Bergmann BA, Moon HK (1997). In vitro adventitious shoot
production in Paulownia. Plant Cell Rep, 16: 315~319
Hcini K, Walker DJ, Bouzid S, González E, Frayssinet N, Correal
E (2006). Determination of ploidy level and nuclear DNA
content in Tunisian populations of Atriplex halimus L. Gen
Res Crop Evol, 53: 1~5
Rao CD, Goh CJ, Kumar PP (1996). High frequency adventitious
shoot regeneration from excised leaves of Paulownia spp.
cultured in vitro. Plant Cell Rep, 16: 204~209